CNTF基因A/G多态性与我国优秀单板U型场地运动员运动能力的相关性分析

李 丽，赵玉华，赵文艳，刘继志，穆大伟，王 旋，李万哲，赵晨琼，张政龙，王宏坤

近年来，分子生物学技术取得突飞猛进的发展，此技术被广泛运用于各个领域。研究结果显示:人体的机能、形态以及运动能力是基因变异、基因与环境相互作用的结果。［1］只有具有运动天赋的运动员才有可能成为世界级的优秀运动员。［2］基因选材成为科学、准确、客观的选材方法。国内外已成立相关的实验室。我国夏季项目现已开展基因选材，冬季项目由于受地域、经济发展、比赛成绩及参与人数等多方影响开展的较缓慢、且项目较少。单板U 型场地成为我国雪上项目冲击冬奥会金牌的“潜优势”项目。［3］力量素质对此项目的运动成绩起到重要作用。CNTF 基因在神经营养与损伤修复中得到了大量试验的支持，与运动相关性也有一些报道如Roth SM 等研究显示:美国人携带CNTF 基因不同基因型的人其肌肉力量有明显差异。［4］CNTF 与运动相关性实验研究数据少，但也出现不同的结论。杨晓琳［5］对优秀举重运动员与普通对照组CNTF 基因A/G 多态位点的基因型和等位基因分布进行研究，结果都不具统计学意义。文章旨在进一步探究CNTF 基因与运动能力的相关性(尤其是我国滑雪运动项目)，为冰雪运动员基因选材提供数据。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象

实验组:单板U 型场地运动员20 名。测试对象来自于中国国家队和黑龙江省滑雪队，国际级运动健将10 名，国家一级运动员10 名(男10 名、女10 名)。平均训练年限8.05 ±1.05年，年龄14－24 岁。测试时健康。

对照组:哈尔滨体育学院2012 级社会体育系、人体科学与健康系115 名普通大学生，年龄17～22 岁。测试人员均为北方汉族，未经任何专业训练且无运动家族史，测试时体检合格。

1.2 实验内容

采用PCR－RFLP 方法对实验组和对照组CNTF 基因A/G 多态性的频率及多态性的分布特征进行分析。

1.3 实验仪器

PCR 扩增仪(基因有限公司Gene Amp PCR System 2700);电泳仪(北京市六一仪器厂DYY－Ⅱ型);上海复日紫外分析装置、成像系统及其软件(FR－200)

1.4 CNTF 基因A/G 多态性测定过程

1.4.1 提取全血总DNA 取静脉血3ml，加入带有2% EDTA 抗凝试管中，以白细胞制备模板DNA，采用天根公司全血总DNA 提取专用试剂盒提取。

1.4.2 引物的选择、合成及扩增 参考Thome［6］等报道的引物序列，由上海捷瑞生物工程公司进行合成，常规处理保存。

引物序列:S 5＇－GCC AGT GAG ATG AGT GAG ATT TTG－3＇

AS 5＇－CAG GTT GAT GTT CTT GTT CAT GCC－3＇

1.4.3 扩增体系

(1)25μL 反应体系:dNTP:0.5μL，5 × Taq buffer:5μL 上、下游引物各1μL，Taq 酶:0.125μL，模板DNA:2μL，去离子水补足。

(2)反应条件:预变性温度设置为95℃，时间为5min。变性温度设置为94℃，时间为30s，退火温度设置为60℃，时间为20s;延伸温度设置为72℃，时间为10s，共35 个循环。终末延伸温度设置为72℃，时间为7min。最后4℃保存。扩增产物以3%琼脂糖凝胶电泳50min。

1.4.4 酶切体系

20μl 反应体系:HaeⅢ限制性内切酶:0.5μL，BSA:0.2μL，扩增产物17.3μL，10 ×buffer:2μL。

反应条件:37℃水浴，3h。

1.4.5 电泳 以DNA Marker DL 600 为片段长度标志，将酶切产物放于含有3%琼脂糖凝胶内，电压100V，电泳40min。在凝胶成相仪中成像，成像结果留取照片。

1.5 数据处理

数据由SPSS 16.0 for Windows 软件包处理。经过基因平衡定律(Hardy－Weinberg，H－W)以确认所选人群是否具有群体代表性。等位基因和基因型频率采用基因计数法计算。组间等位基因和基因型频率分布采用卡方检验。P＜0.05 为具有统计学差异，P＜0.01 为具有统计学差异非常显著性。

2 CNTF 基因型的判断与实验结果

2.1 CNTF 基因型的判断

CNTF(睫状神经因子)基因设计引物扩增后的长度为134bp，经HaeⅢ酶切后(含酶切位点)的等位基因为94bp、40bp，定义为G，而不含酶切位点的等位基因134bp 定义为A，出现的三种基因型是G/A、A/A 、G/G。(见图1)Lane1 为Marker(100 200 300 400 500 600 bp);lane2、3、5、6、7、8、9、10、13 为纯合子G/G 电泳带;lane4 为纯合子AA 电泳带;Lane11、12 杂合子A/G ;Lane14 为PCR 产物。

图1 CNTF 基因琼脂糖凝胶电泳图

2.2 实验结果

由表1 得出:所选取的对照组基因型频率符合Hardy－Weinberg 平衡(P ＞0.05)，但运动员不符合Hardy－Weinberg 平衡(P＜0.05)，表明对照组具有群体代表性，因运动员是特殊人群，可不具有群体代表性。

表1 CNTF 基因A/G 多态频率分布的Hardy－Weinberg 平衡检验表

由表2 可知:实验组与对照组CNTF 基因A/G多态性的G 等位基因频率都较高，A 等位基因分别为17.5%、18.7%，卡方检验P ＞0.05，无统计学差异。

表2 实验组与对照组CNTF 基因A/G 多态性的等位基因频率表

由表3 得出:实验组与对照组CNTF 基因A/G 多态性的基因型频率χ2=1.239、P =0.538、P ＞0.05，无统计学差异。

表3 实验组与对照组CNTF基因A/G 多态性的基因型频率

3 分析与讨论

睫状神经营养因子基因，定位于11q12，它是脑源性神经营养因子，能对副交感神经起到营养作用。［7］Rosenberg LJ 等研究结果:脊髓运动神经元因毒物而死亡，如用CNTF 已死亡的运动神经元可再生。［8］Forger NG 等研究表明，CNTF 可使肌纤维数量增加2－3倍。［9］Roth 等研究:CNTF 存在于骨骼肌纤维中的受体对肌纤维的生长、功能都有营养和调节作用。［10］这也许是CNTF 基因与力量素质相关的原因之一。Roth等首次健康人群进行了CNTF 基因A/G 多态性与肌肉力量关联性研究，结果CNTF 基因G 多态性肌肉力量可具有相关性。［11］

本研究所选单板U 型场地运动员，此项目属于技能主导类表现性难美项群。以糖酵解系统和磷酸原供能系统为主，是强度大、时间短的运动。主要对力量(特别是腰腹肌、背部、爆发力和下肢弹跳力)、动作速度、灵敏、平衡力及前庭功能的稳定性要求极高。力量素质是所有身体素质的基础也是高质量地完成技术动作的前提。力量有关的基因对单板U 型场地运动员选材有十分重要的作用。我国在单板U 型场地滑雪项目在我国引入较晚，但发展迅速，已在国际大赛中取得了优异成绩。［12］如索契冬奥会获得男子单板U 型场地第六名的张义威，女子小将刘佳宇，5 次参加世界杯单板U 型场地分站赛拿得1 金1 银。本研究所选取运动员来自于中国国家队和黑龙江省省队，所选队员为运动健将和国家一级运动员包括出战索契冬奥会所有选手，可以说所选运动员代表中国单板U型场最高水平。研究表明:实验组与对照组CNTF基因A/G 多态性的基因型频率和等位基因频率都不具有统计学差异，但GG 基因型所占比例大。与国内外相关报道运动员与非运动员组CNTF 等位基因和基因型频率都有统计学差异，结果不一致。

探究其可能原因:研究所选取对象虽是中国最优秀单板U 型场地运动员但数量只有20 人，人数少是不具有群体代表性的最主要原因。遗传学实验样本量是影响实验结果最主要的因素之一［13］。本研究因运动项目及运动员本身数量偏少的局限性，如加大样本量或同一项群的项目作为研究对象可得到更加客观的结论。对照组未曾受过专业训练，但体育学院学生可能与普通人不同，也会使结果无统计学意义。与国内外多数结果不一致，存在差异的可能原因:人种不同是主要原因之一;小群体样本中所选取样本的微小波动可能会造成不同的结论。另一种可能性，CNTF 基因A/G 多态性与单板U 型场地运动员的力量素质没有相关性，不能成为早期选材的指标。

4 结论

(1)所选取对照组基因型频率符合Hardy－Weinberg 平衡(P ＞0.05)，具有群体代表性。

(2)CNTF 基因A/G 多态性不能作为中国技能主导类优秀滑雪运动员选材的指标之一，但GG基因型所占比例大。

［1］朱玉贤，李毅.现代分子生物学［M］.北京:高等教育出版社，1997:231－232.

［2］高炳宏.海汉族优秀耐力运动员ACE 基因I/D 多态性与最大有氧能力(VO2max)的关联研究［J］.体育科学，2006，26(2):42－43.

［3］刘江，单清国.我国自由式滑雪空中技巧项目的科学选材［J］.冰雪运动，2010，32(2):39－421.

［4］Roth SM，Schrager MA，Ferrell RE，et al.CNTF genotype is associated with muscular strength and quality in humans across the adult age span［J］.J Appl Physiol，2001(90):1205－1210.

［5］杨晓琳，胡 杨，李燕春.从CNTF 基因筛选举重运动员选材用分子标记的研究［C］.北京:第四届中国体育博士高层论坛论文摘要集，2012:37－38.

［6］Thome J，Rosler M，Riederer P，et al.In reply－CNTF and psy－chiatric disorders(ltr)［J］.Nature Genet，1996(13):144.

［7］熊正英，李侠，赵书勤.睫状神经营养因子(CNTF)在运动人体科学中的研究展望［J］.四川体育科学，2009，6(2):27－31.

［8］Rosenberg LJ，Lucas J H.The effects of ciliary neurot rophic factor on murine spinal cord neurons subjected to dendrite transaction injury［J］.Brain Res，1997(775):209 –213.

［9］Forger NG，Wong V，Breedlove SM，et al.Ciliary neurotrophic factor arrests muscle and motoneuron degeneration in and rogen－insensitive rats［J］.Neuro sci，1995(28):354－362.

［10］Roth Stephen M，Schrager Matthew A，Ferrell Robert E，et al.CNTF genotype is associated with muscu－lar strength and quality in humans across the adult age span［J］.Journal of Applied Physiology，2001，90(4):1205－1210.

［11］Roth MS，Schrager AM，Ferell ER，et al .CNTF genotype is associated with muscular strength and quality in humans across the adult age span［J］.Appl Physiol，2001(90):1205－1210.

［12］李淑媛.第6届亚冬会我国单板滑雪项目分析［J］.吉林师范大学学报，2008，30(1):119－121.

［13］王志军，穆淑敏，周建芝.ACE 基因多态性与血管疾病的相关性研究［J］.中国煤炭工业医学杂志，2001，4(12):955.