气相色谱－三重四极杆串联质谱稳定同位素稀释法测定被动吸烟儿童尿液中的可丁宁

王 芸， 黄志强， 叶 英， 张 莹， 肖水源

（1.中南大学公共卫生学院，湖南 长沙410078；2.湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙410004；3.岛津企业管理（中国）有限公司，广东 广州510000；4.新疆医科大学护理学院，新疆 乌鲁木齐830000）

世界上约有40%的儿童被动吸烟；在因被动吸烟早死的60万人中，儿童约占28%。儿童被动吸烟易引起呼吸道感染、中耳炎、支气管炎、哮喘、咳嗽症状以及行为和认知障碍［1］。进入人体内的尼古丁约80%经细胞色素氧化酶CYP2A6代谢为可丁宁，而可丁宁在体内的半衰期为18～22 h，较尼古丁延长了约20 h，且尼古丁是可丁宁的唯一来源，从而更能反映人体3～4天被动吸烟情况。由于可丁宁在人体体液、脏器以及头发、趾甲等部位分布广泛［2］，因而被公认为被动吸烟最佳的生物标志物［3，4］。

生物样品中可丁宁的检测方法主要有放射免疫法［5］、酶联免疫法［6，7］、气相色谱法［8，9］、气相色谱－质谱法［10，11］、液相色谱法［12］、液相色谱－质谱法［13］、液相色谱－串联质谱法［14－17］和气相色谱－串联质谱法（GC－MS／MS）［18］等。但 GC－MS／MS技术在对被动吸烟人群可丁宁的分析应用报道较少，方法的定量限在1～0.5μg／L 之间，难以满足儿童尿液中可丁宁的测定要求。本文采用三氯甲烷提取、净化，GC－MS／MS检测被动吸烟儿童尿液中的可丁宁，基质匹配内标同位素稀释法定量，方法定量限达到0.1μg／L。本方法操作简便、准确、灵敏、稳定性好，可以用于被动吸烟儿童尿液中可丁宁的监测和吸烟人群戒烟效果的评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱－三重四极杆质谱联用仪（GCMSTQ8030，日本岛津公司）；高速台式离心机（UNIVERSAL 320，德国 Hettich公司）；快速混匀器（AHYQ SK－1，常州澳华仪器有限公司）；可丁宁（cotinine，纯度为98%，购于美国Sigma公司）；可丁宁－d3（cotinine－d3，纯度为99%，加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；三氯甲烷（色谱纯）；无水硫酸钠（分析纯，用前在500℃马弗炉内烘5 h，冷却后放入干燥器中备用）；实验用水均为蒸馏水。

1.2 标准溶液配制

标准溶液配制：称取10.00 mg可丁宁标准品置于5 mL小烧杯中，用三氯甲烷溶解后转移到100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为100 mg／L 的单标准储备液，贮存在－20℃冰箱中备用。称取10.00 mg可丁宁－d3标准品于100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为100 mg／L单标准储备液，贮存在－20℃冰箱中备用。

标准工作液配制：用空白尿液基质提取液和标准储备液配制成0.1、0.5、1、5、10μg／L 的可丁宁及2μg／L 可丁宁－d3混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

尿液于5℃冰箱中冷藏保存。分析时，先将尿液在室温下放置10 min，取2.0 mL尿液于试管中，加入 20μg／L 可 丁宁－d3溶液 200μL，加入 1 mol／L氢氧化钠溶液调节尿液pH为10，再加入1 mL饱和硫酸钠溶液，最后加入2.0 mL三氯甲烷溶液，于涡旋混合器上充分混匀1 min，以 7 000 r／min速度离心10 min，下层有机相收集于自动进样瓶中，供GC－MS／MS测定。

1.4 分析条件

色谱柱：Rxi－5 Sil MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm（美国RESTEK公司）；载气：高纯氦气（纯度99.999%），柱内流量1.48 mL／min；柱温程序：初始温度60℃（保持0.5 min），以40℃／min 升温至200℃（保持0.5 min），再以10℃／min 升温至220℃（保持0.5 min），最后以40℃／min 升温至300℃（保持3 min）；进样口温度：270℃；进样量：1μL；进样方式：不分流进样，进样时间1 min；总运行时间12 min。

离子源温度：230℃；电离模式：电子轰击电离（EI）；轰击能量：70 eV；灯丝电流：150μA；碰撞气：氩气（纯度99.999%）；碰撞电压：可丁宁8 eV，可丁宁－d36 eV；溶剂延迟时间：4.5 min；数据采集模式：多反应监测（MRM）。可丁宁定量离子对为m／z 176.10＞98.05，定 性 离 子 对 为 m／z 176.10＞147.05和 m／z 147.05＞118.05；可丁宁－d3定量离子对为m／z 179.10＞101.10，定性离子对为 m／z 179.10＞147.05和m／z 101.10＞73.05。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

选取正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等3种溶剂，按前述样品前处理步骤处理尿液，采用正己烷、乙酸乙酯提取尿液时，絮状沉淀物多，乳化现象非常严重，分层困难，可丁宁加标回收率非常低；而采用三氯甲烷提取时分层明显，无乳化现象，加标回收率稳定，故选择了三氯甲烷作为萃取溶剂。

2.2 基质效应的考察

采用三氯甲烷溶液和空白尿液提取液配制不同浓度的标准溶液，两种溶液等体积进样，测量峰面积，比较两组溶液响应值的差异，结果如图1所示。经配对t检验，两者差异有统计学意义（p＝0.030），图1表明基质提取液对可丁宁响应信号有明显增强作用，尿液基质效应明显。因此，本实验采用基质匹配标准溶液进行校正。

2.3 GC－MS／MS条件优化

图1 三氯甲烷和空白尿液基质中的可丁宁在GC－MS／MS分析中的峰面积Fig.1 Peak areas of the cotinine in chloroform and blank urine matrix by GC－MS／MS analysis

图2 （a）空白尿液提取液、（b）空白尿液基质匹配可丁宁（10 μg／L）和内标可丁宁－d3（2μg／L）混合标准溶液 MRM的总离子流色谱图和（c）可丁宁的离子对色谱图Fig.2 MRM total ion chromatograms of（a）blank urine matrix，（b）blank urine matrix spiked with the cotinine（10μg／L）and internal standard cotinine－d3（2μg／L）mixed standard solution and （c）MRM chromatogram of transition of cotininePeak identifications：1.cotinine－d3；2.cotinine.

空白尿液提取液、空白尿液基质匹配可丁宁和可丁宁－d3混合标准溶液的总离子流色谱图见图2a和2b；在2～40 eV范围内优化碰撞电压，最终选定m／z 176.10＞98.05作为可丁宁的定量离子对，m／z 176.10＞147.05和m／z 147.05＞118.05作为可丁宁的定性离子对 （见图 2c）；m／z 179.10＞101.10作为可丁宁－d3的定量离子对，m／z 179.10＞147.05和m／z 101.10＞73.05作为可丁宁－d3的定性离子对，与其他质谱检测采用优化方法一致［19］。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围和定量限

本文采用空白尿液基质提取液（按1.3节制备）准确配制含量分别为0.1、0.5、1、5和10μg／L 的系列混合标准溶液，按照1.4节条件进行测定，以可丁宁浓度／可丁宁－d3浓度比值与可丁宁峰面积／可丁宁－d3峰面积比值绘制曲线图，可丁宁在空白尿液基质中的线性关系良好，其线性范围为0.1～10 μg／L，在相应的含量范围内线性相关系数（r）大于0.998。在信噪比（S／N）大于10时，通过回收率试验确定儿童尿液中可丁宁的定量限为0.1μg／L，能够满足被动吸烟儿童尿液中可丁宁的测定。

2.4.2 回收率

在空白儿童尿液中分别添加0.1、1和10μg／L的可丁宁进行回收率试验；对含有可丁宁的儿童尿液分别添加大约0.5倍、2倍和4倍本底值浓度的可丁宁进行回收率试验。测定结果见表1。

表1 尿液样品中可丁宁的加标回收率和相对标准偏差（n＝6）Table 1 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of cotinine spiked in urine samples（n＝6）

表1数据表明：可丁宁在尿液中的回收率为79.2%～112.8%，相对标准偏差在6%以内。与其他研究［6，20，21］相比有较好的准确度和精密度；方法准确度、精密度能满足被动吸烟儿童生物标志物可丁宁的检测要求。

2.4.3 日内和日间精密度和准确性

在空白尿液中分别加入0.1、1和10μg／L 可丁宁及2μg／L可丁宁－d3混合溶液，分别平行处理6个样品，按前述方法进行测定，结果见表2。

表2 尿液中可丁宁测定的日内、日间精密度和准确性Table 2 Intra－day and inter－day precisions and accuraciesof analysis for cotinine in urine samples

2.4.4 稳定性

标准工作液的稳定性：以三氯甲烷溶液配制3个不同浓度（0.3、1和10μg／L）的可丁宁及2μg／L可丁宁－d3标准工作液，分别在当天和室温下在自动进样器上放置24 h后检测，重复测量6次。两次测得的结果相对偏差均小于1%。同时对两组数据进行配对t检验，经统计学检验，两组数据无统计学意义（p≥0.05）。说明标准工作液在常温下放置24 h内稳定。

处理后的尿样稳定性：室温下将尿样提取液放置在自动进样器上至少24 h。24 h后对10个尿样提取液进行检测，相对偏差小于1%，说明常温下尿样提取液在24 h内稳定。

短期稳定性：尿样在5℃和－10℃下储存，分别在第0、1、2、3和5天进行检测，每个浓度重复2次。在5℃条件下，测得结果的相对偏差小于4%；－10℃条件下，测得结果的相对偏差小于3%。说明尿样可以在5℃和－10℃条件下稳定储存5天。

长期稳定性：将尿样储存在－20℃的冰箱内，在第0、3、5、13、15、20、28天分别进行检测，每个浓度重复测量2次。测得结果的相对偏差小于2%。实验结果表明：在－20℃条件下储存尿样28天，尿样是稳定的。

融冻循环的稳定性：样品储存在－20℃冰箱内24 h后，取出在室温下自行融化。当尿样完全融化后，再次放入相同条件下冷冻24 h。这个融冻循环重复2次后样品被再次分析，至少在3次融冻循环下，相对偏差小于10%说明样品是稳定的。我们对5个儿童尿样进行了分析，结果相对偏差均超过10%，提示尿样在反复融冻循环下，稳定性较差。

2.5 实际样品测定

为验证方法的有效性，对幼儿园60名5～6岁被动吸烟儿童尿液进行了检测。60名被动吸烟儿童中有10名儿童尿液未检测出可丁宁，即尿液中的可丁宁＜0.1μg／L，50名被动吸烟儿童尿液检测出可丁宁质量浓度范围在0.42～27.76μg／L。

3 结论

采用三氯甲烷萃取、净化，建立了GC－MS／MS同位素稀释法测定被动吸烟儿童尿液中可丁宁的方法，方法的线性、准确度、精密度满足方法学要求，方法定量限达到0.1μg／L，可以对儿童尿液中痕量可丁宁进行定量检测和确证。方法准确、可靠、快速、灵敏，可作为儿童被动吸烟的监测、个体吸烟和被动吸烟者自报准确性的验证，也可作为评价戒烟和被动吸烟干预的有效手段。

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