金纳米分光光度法测定尿中痕量鸟苷

刘慧，徐薇，王永生

(南华大学公共卫生学院，湖南衡阳 421001)

鸟苷是嘌呤核苷类物质的一种，在药品和食品行业中是一种非常重要的中间体，并且它在制造无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等药物当中充当主要原料。同时，鸟苷还在当今一些癌症的确诊中也突显出了其重要意义［1-2］。目前，检测鸟苷的主要手段有高效液相色谱法［3］、分子印迹固相微萃取［4］、毛细管电泳法［5］、薄层扫描法［6］等。虽然这些方法都有其优点，但普遍存在操作费时和设备昂贵等缺点。本研究基于鸟苷与金纳米间的相互作用可改变吸光度的原理，建立了检测鸟苷的金纳米分光光度的新方法。该方法不仅操作简单，而且还具备快速、廉价等优点。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

鸟苷、氯金酸、柠檬酸三钠、氯化钠、Britton-Robinson(BR)缓冲溶液等试剂均为分析纯;实验用水为双蒸灭菌水。

岛津UV2550紫外-可见分光光度计;TG16-WS离心机;AB204-S电子分析天平;PB-20酸度计。

1.2 金纳米粒子制备

根据文献［7-8］，金纳米粒子可用柠檬酸还原法制得，再用0.22 μm的滤膜过滤。紫外-可见吸收光谱下520 nm 处消光系数为2.7 ×108(mol·cm－1)，浓度约为8.1 nmol/L，粒径大小约(15±2)nm。

1.3 实验方法

在2 mL EP管中，依次加入pH 3.6 BR缓冲液100 μL，金纳米溶液 40 μL，放置 10 min，待反应完全后，加入鸟苷及氯化钠70 μL，并用双蒸灭菌水加至500 μL，放置5 min。在UV-2550紫外可见分光光度计上200～700 nm进行扫描，得到紫外吸收光谱。取λ630和λ530处的吸光度比值为检测信号，用ΔA630/A530与不同浓度鸟苷建立标准曲线进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 光谱特征

图1b为制得金纳米粒子(AuNPs)溶液的吸收光谱，其溶液为酒红色，最大吸收峰在530 nm附近加入鸟苷后，溶液颜色由酒红色变为蓝紫色，530 nm吸收强度减小，而在630 nm处出现一个新的吸收峰(见图1c)。将鸟苷加入AuNPs溶液后，引起了AuNPs的聚集，从而在630 nm出现了一个新的吸收峰。

图1 鸟苷检测体系的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra of guanosine system

图2为鸟苷-AuNPs体系紫外-可见图谱。

图2 AuNPs中加入不同浓度鸟苷的吸收光谱图Fig.2 Absorption spectra of AuNPs with different concentration of guanosinea.金纳米 +鸟苷1.41 ×10－6mol/L;b.金纳米 +鸟苷1.13 ×10－6mol/L;c.金纳米 +鸟苷8.47 ×10－7mol/L;d.金纳米 +鸟苷5.64 ×10－7mol/L;e.金纳米 + 鸟苷2.82 ×10－7mol/L;f.金纳米 +鸟苷1.76 ×10－7mol/L;g.金纳米

由图2可知，在pH 3.6 BR缓冲液中，随着加入鸟苷的体积增加，不同浓度鸟苷体系ΔA630/A530比值也不断增加且在一定范围内与吸收强度成线性关系。金纳米粒子由带负电荷的柠檬酸根保护，使得金纳米粒子在溶液中均匀分散。加入鸟苷后，金纳米粒子间的静电斥力减弱，使得金纳米粒子聚集，粒径增大，导致溶液颜色发生变化，同时体系的吸收光谱也发生变化。

2.2 实验条件的优化

2.2.1 体系酸度及用量的优化 由图3可知，在BR缓冲液中，随着pH增大，ΔA630/A530也相应增大，当pH在3.0～4.0时ΔA630/A530先缓慢增加后又会降低，当pH 达到3.6时，ΔA630/A530也达到最大，故本研究选定pH为3.6的BR缓冲溶液控制体系的酸度。另外，用量为100 μL时，ΔA630/A530最大。因此，本实验中我们选定BR缓冲液用量为100 μL。

图3 pH值对体系的影响Fig.3 The effect of pH value on the system

2.2.2 AuNPs用量的优化 实验证实，随着AuNPs用量的增加，体系的吸光度也会随之发生一系列变化。当加入40 μL的金纳米时，ΔA630/A530最大。因此，本研究选定金纳米的加入量为40 μL。

2.2.3 反应时间的优化 将鸟苷加入金纳米溶液后，每间隔2 min用紫外分光光度计扫描一次。当两者反应10 min时，溶液颜色不再改变，再加入一定量的 NaCl溶液，并静置6 min，ΔA630/A530比值以及金纳米粒子颜色变化趋于稳定。因此，选择金纳米与鸟苷的反应时间为10 min，加入氯化钠静置时间为6 min。

2.2.4 试剂加入顺序的优化 在优化的实验条件下，做试剂加入顺序对反应体系影响的实验。结果表明，以BR→AuNPs→鸟苷→NaCl的加入顺序所得实验结果最好，且稳定时间长，故本实验选用BR→AuNPs→鸟苷→NaCl加入顺序。

2.3 干扰实验

在优化的实验条件下，鸟苷浓度为2.58×10－6mol/L，实验了可能共存的多种离子和物质对体系的影响。结果表明，当相对标准偏差≤±5%时，50 倍的 Al3+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、F－、Cl－、Br－、HC、N、HS、S、腺苷、葡萄糖、EDTA，10倍的脱氧鸟苷等对本体系没有影响。说明这种方法有良好的选择性，取样后只需通过离心去除大分子物质便能够进行实时检测分析。

2.4 标准曲线、检出限及精密度

在优化实验条件下，通过加入不同体积的鸟苷标准溶液，绘制校正工作曲线。当鸟苷浓度在1.75×10－8～6.27 ×10－6mol/L 时，与体系 ΔA630/A530有较好的线性关系，线性方程为ΔA630/A530=1.33c×10－6mol/L+0.017 5，相关系数 r=0.997。根据11次空白样品的平行测定，按公式LOD=3Sb/k(Sb和k分别为空白管的标准差和直线回归方程的斜率)计算可得本研究的检出限为5.26×10－9mol/L。在最佳条件下，平行配制11管浓度分别为1.372×10－7，2.744 ×10－7，1.098 ×10－6mol/L 的鸟苷标准溶液进行精密度实验，相对标准偏差(RSD)分别为3.75%，2.98%和 1.42%。

2.5 样品分析

采集衡阳市南华大学第二附属医院尿样3份和南华大学健康学生尿样1份，样品通过离心机(2 000 r/min)离心10 min，取上清液测定样品中的鸟苷含量和加标回收率，结果见表1。

表1 尿样分析结果(n=6)Table 1 The determination results of guanosine in human urine samples

3 结论

在本实验条件下，鸟苷与AuNPs结合，屏蔽了金纳米粒子间的静电斥力，使金纳米聚集，导致体系的颜色及吸光度值发生变化，且在一定的浓度范围，体系吸光度比值与鸟苷的浓度具有良好的线性关系，据此建立了金纳米分光光度法测定尿样中痕量鸟苷的新方法。该新方法具有简单、快速、廉价、选择性好的优点。

［1］郑育杰，陈英杰，逢涛.肠癌患者尿中排放鸟苷的高效液相色谱法研究［J］.色谱，2002，20(2):43-46.

［2］陈英杰，郑育芳，王凝芳.尿中核苷检测在胃癌诊断中的意义［J］.癌症，2003，3(5):537-540.

［3］赵杨，靳凤云，伍庆，等.高效液相色谱法测定贵州不同产地半夏药材中鸟苷和腺苷的含量［J］.时珍国医国药，2007，18(1):23-24.

［4］陈双喜，蔡显鹏，王仲石，等.鸟苷发酵的优化研究［J］.微生物学通报，2002，29(5):65-69.

［5］王祝伟，孙毓庆.毛细管电泳法测定红毛五加茎皮中鸟苷的［J］.应用化学，2004，21(1):32-34.

［6］高道侠，许敏.薄层扫描法测定金水宝胶囊中鸟苷的含量［J］.江西中医学院学报，1998，10(3):131.

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