沙美特罗替卡松粉吸入剂对大鼠慢性阻塞性肺疾病气道重塑的影响

金明哲，熊瑛

(泸州医学院附属医院呼吸一科，泸州 646000)

沙美特罗替卡松粉吸入剂对大鼠慢性阻塞性肺疾病气道重塑的影响

金明哲，熊瑛

(泸州医学院附属医院呼吸一科，泸州 646000)

目的 探讨不同剂量沙美特罗替卡松粉吸入剂(ICS/LABA)对大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑的干预作用。方法将40只Wistar大鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、低剂量ICS/LABA组(C组)、高剂量ICS/LABA组(D组)。采用烟熏加气管内注射脂多糖(LPS)法复制COPD模型,C、D组吸入中、高剂量ICS/LABA。观察肺功能和病理变化,肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数和百分比,图像分析测量小气道平滑肌和管壁厚度,酶联免疫吸附(ELISA)法测定BALF中转化生长因子β1(TGF-β1)的表达,免疫组化法测定肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肺组织中MMP-9mRNA的表达。结果B组肺间质大量炎性细胞浸润,肺泡壁破坏,肺大疱形成,气管管壁和平滑肌增厚,C、D组有所减轻;B组TGF-β1、MMP-9水平与A组大鼠相比明显升高,SLPI则显著降低(P＜0.05);干预后C、D组TGF-β1、MMP-9水平与B组相比明显降低,而SLPI则明显升高(P＜0.05);D组TGF-β1、MMP-9阳性系数和mRNA相对含量[(82.06±4.43)(2.41±0.22) (6.156±8.86)]显著低于C组[(118.59±5.28)(3.09±0.28)(9.616±10.56)](P＜0.05),而SLPI(2.95±0.28)明显高于C组(2.11±0.26)(P＜0.05)。结论ICS/LABA对COPD大鼠肺泡破坏及气道重塑有抑制作用,且高剂量优于低剂量,其机制可能与降低TGF-β1和MMP-9的表达及提高SLPI的水平有关。

沙美特罗替卡松粉吸入剂；肺疾病,阻塞性,慢性；转化生长因子β1；金属基质蛋白酶9；分泌性白细胞蛋白酶抑制物

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要特征为肺部慢性炎性、气道重塑和动态气体陷闭,其与有害刺激引起肺部异常炎症反应有关,吸烟及感染等导致炎症细胞在气道局部聚集,促进炎症递质和细胞因子释放[1],同时抑制具有保护性的细胞因子的表达,致使炎症迁延不愈,最终导致气道重塑。吸入性糖皮质激素/长效β2受体激动药(inhaled corticosteroids/long-acting β2agonists,ICS/LABA)在COPD应用低剂量尚存争议,虽然经TORCH和INSPIRE临床研究[2-3],发现ICS/LABA可改善COPD患者肺功能,降低急性发作频率,但长期大剂量应用不良反应大,突然停药后可增加肺炎发生率等。ICS/LABA是否具有调控COPD气道重塑的作用,笔者尚未见报道。为此,笔者采用烟熏加气管内注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)法建立COPD模型,观察不同剂量ICS/LABA对COPD大鼠气道重塑及转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)表达的影响,探讨低、高剂量ICS/LABA对COPD动物模型气道重塑的调控作用,为临床治疗COPD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组 SPF级雄性Wistar大鼠[合格证号:SCXW(渝)2007-0003]40只,平均体质量(160± 20)g,重庆鑫腾生物公司提供,许可证号:SCXW(渝) 2007-0008。随机分为对照组(A组)、COPD模型组(B组)、低剂量ICS/LABA(舒利迭,葛兰素史克公司提供)组(C组)、高剂量ICS/LABA(同上)组(D组),每组10只。

参照宋一平等[4-5]所用方法复制动物模型,并进行改良:B组大鼠在实验第1天、第14天,用2%戊巴比妥钠(25 mg·kg-1)腹腔内注射麻醉,用1 mL注射器穿刺气管,注射LPS[200 μg·(200 μL)-1](美国Sigma公司)。分别在实验第2～13天、第15～45天,每天将大鼠放入容积为60 L的自制密闭玻璃染毒箱(30 cm×40 cm×50 cm)内被动吸烟,方法为:将点燃的香烟(天下秀,川渝中烟工业公司,焦油量10 mg,烟气烟碱量0.8 mg)通过玻璃孔将烟雾注入烟熏箱内,保持烟雾浓度5%,每天2次,每次15支,持续1 h,每组间隔4 h。C、D组造模方法同B组,第16天烟熏前1 h进行干预,每天1次,C组以舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻;D组以舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻。将沙美特罗替卡松粉吸入剂(舒利迭)两喷溶于0.9%氯化钠溶液1.7 mL+聚山梨酯-80 0.3 mL,每只0.3 mL,每天2次。据文献[6-7]报道,此剂量和成人每天1 mg相符;A组:各干预因素均以相同剂量0.9%氯化钠溶液代替,玻璃箱内吸入空气。

1.2 大鼠肺功能测定 实验第46天,以2%戊巴比妥钠(25 mg·kg-1)麻醉大鼠,应用动物肺功能检测仪[7](美国Buxco),测定呼气峰流量(peak expiratory flow,PEF)、第0.3秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3)、FEV0.3/用力肺活量(forced vital capacity,FVC)。

1.3 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞分类与计数及TGF-β1检测 以0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)进行右心室灌注,开胸夹闭右支气管,以0.9%氯化钠溶液3 mL灌洗左肺,反复3次并经纱布过滤,总回收量约7 mL,回收率75%～80%。取BALF4 mL,4℃1 200 r·min-1离心10 min,弃去上清液。离心沉淀细胞成分,用D-Hank` s液冲洗3次,制成细胞悬液。锥虫蓝染色计算细胞活性,活细胞率＞90%。取细胞悬液,在细胞计数板上计数。沉淀涂片,Wringt染色,高倍镜下计数200个细胞进行分类;剩下BALF采用酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA,材料由美国R&D公司提供)检测TGF-β1浓度,按照说明书操作。

1.4 肺组织标本和形态定量分析 取右肺中叶,多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(hematoxylineosinstaining,HE)染色。每只大鼠切片随机选取3个较完整的气道(短长径比＞0.5)。测量管壁总面积(total bronchial wall area,WAt)=气道外壁所围面积(the outer adventitial area,AO)-管壁内侧面积(the inside adventitial area,Ai);平滑肌层面积(smooth muscle area,WAsm)=平滑肌层外侧面积(the outer smooth muscle area,Asmo)-平滑肌层内侧面积(the inside smooth muscle area,Asmi),以管壁内周长(internal perimeter, Pi)进行标准化,结果以单位长度的管壁厚度(Wat/Pbm,μm2·μm-1)和单位长度的平滑肌层厚度(Wasm/Pi,μm2·μm-1)表示。

1.5 大鼠肺组织SLPI和MMP-9检测 采用10%多聚甲醛固定大鼠右肺中叶,石蜡切片,常规脱蜡,按MMP-9(北京博奥森生物技术公司)、SLPI(美国Bioworld Technology公司)免疫组化检测试剂盒说明书操作,抗体浓度均为1∶100。每只大鼠取切片2张,应用HPIAS-1000病理图文分析系统测定每张切片8个视野的阳性系数。阳性系数的计算参见文献[8]。

1.6 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测大鼠肺组织MMP-9mRNA表达 取肺组织标本30 mg,按照Trizol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)说明提取总RNA,逆转录成cDNA(美国MBI公司逆转录试剂盒)。以SYBR Green I作为荧光标志物,在荧光实时定量PCR仪(ABI 7500型)上进行PCR反应。根据GeneBank的cDNA序列设计引物,以β-肌动蛋白为内参照物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。MMP-9上游引物:5'-CATCTGGGGATTGAACTCAG-3',下游引物:5'-GTGGTGTCCTCCGATGTAAG-3',扩增长度为235 bp。β-肌动蛋白上游引物: 5'-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3',下游引物:5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCA-3',扩增长度为221 bp。通过融解曲线和电泳结果确定目的条带并分析,△△Ct法进行目的基因的相对定量。

1.7 统计学方法 采用SAS10.0版软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用F检验,多重比较采用SNK法,指标间相关性检验采用线性相关分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及病理学观察 B组大鼠呼吸急促,口唇发绀,仰卧位呼吸;干预组有不同程度好转。制作模型时共死亡6只。光镜下观察,A组肺组织无异常改变;B组各级支气管明显狭窄,气管管壁及平滑肌增厚,黏膜下成纤维细胞增生,杯状细胞显著增多,间质内有大量炎性细胞浸润,肺泡壁破坏,肺泡腔扩大,部分破裂融合形成肺大泡;C、D组气管增厚程度和肺大泡数目较模型组均有所减轻,炎性细胞浸润减少。

2.2 大鼠肺功能结果 与A组比较,B组大鼠PEF、 FEV0.3和FEV0.3/FVC显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。C、D组大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均明显高于模型组,差异有统计学意义(均P＜0.05);干预组间比较,D组差异有统计学意义(P＜0.05),见表1。

2.3 BALF中细胞总数及分类、TGF-β1表达水平 B组BALF中细胞总数、中性粒细胞数和单核巨噬细胞数及TGF-β1浓度明显高于A组(P＜0.05);干预组细胞总数、中性粒细胞数和单核巨噬细胞数及TGF-β1浓度明显低于B组(P＜0.05);干预组间比较,D组差异明显(P＜0.05)。见表2。

2.4 各组大鼠支气管形态学比较 B组小支气管管壁、平滑肌厚度明显高于A组(P＜0.05);干预组则显著低于B组(P＜0.05);干预组间比较,D组降低明显(P＜0.05),见表3。

2.5 MMP-9在大鼠支气管肺组织的免疫组化表达 MMP-9在肺泡上皮细胞等免疫染色呈强阳性,以细胞质着色为主。B组MMP-9呈强阳性表达;A组MMP-9呈弱阳性表达,二组阳性系数差异明显(P＜0.05);干预组MMP-9呈中度阳性表达,阳性系数与模型组的差异均有统计学意义(P＜0.05);干预组间比较,D组差异明显(P＜0.05),见表3。

2.6 SLPI在大鼠支气管肺组织的免疫组化表达 SLPI在气管、支气管上皮细胞免疫染色呈阳性,仅在管腔侧细胞膜有着色。A组SLPI呈强阳性表达;B组为弱阳性表达,二组的阳性系数差异有统计学意义(P＜0.05);干预组比模型组SLPI表达明显增强,阳性系数与模型组的差异均有统计学意义(P＜0.05);干预组间比较,D组差异明显(P＜0.05),见表3。

表1 4组大鼠肺功能检测值Tab.1 Lung function in four groups of rats ±s

表1 4组大鼠肺功能检测值Tab.1 Lung function in four groups of rats ±s

与B组比较,*1P＜0.05;与A组比较,*2P＜0.05;与C组比较,*3P＜0.05Compared with group A,*1P＜0.05;Compared with group B,*2P＜0.05;Compared with group C,*3P＜0.05

组别大鼠/只PEF/(mL·s)FEV0.3/mLFEV0.3-1/FVC/% A组1041.88±3.26*14.78±0.54*189.63±5.42*1B组721.50±1.78*23.71±0.58*265.27±6.58*2C组930.62±2.31*1*24.43±0.47*1*280.00±4.56*1*2D组833.13±2.62*1*2*34.39±0.50*1*2*382.34±5.07*1*2*3

表2 4组大鼠BALF细胞计数和TGF-β1浓度Tab.2 Comparison of BAL cell count and TGF-β1among four groups of rats ±s

表2 4组大鼠BALF细胞计数和TGF-β1浓度Tab.2 Comparison of BAL cell count and TGF-β1among four groups of rats ±s

与B组比较,*1P＜0.05;与A组比较,*2P＜0.05;与C组比较,*3P＜0.05Compared with group B,*2P＜0.05;Compared with group A,*1P＜0.05;Compared with group C,*3P＜0.05

组别大鼠/只细胞总数/(×108·L-1)中性粒细胞淋巴细胞单核巨噬细胞% TGF-β1浓度/(μg·L-1) A组109.35±0.62*118.42±6.37*115.79±3.56*174.63±6.71*152.02±4.37*1B组714.82±0.96*230.17±9.28*212.36±4.27*255.87±5.49*2148.39±4.97*2C组912.51±1.21*1*226.72±5.62*1*213.58±3.04*1*261.49±7.03*1*2118.59±5.28*1*2D组810.63±1.07*1*2*322.64±7.48*1*2*314.29±4.01*1*2*365.72±5.29*1*2*382.06±4.43*2*3

表3 4组大鼠支气管形态学、肺组织SLPI、MMP-9及其mRNA相对含量比较Tab.3 Comparison of bronchial morphology,SLPI,MMP-9 in lung and the relative content of MMP-9 mRNA among four groups of rats ±s

表3 4组大鼠支气管形态学、肺组织SLPI、MMP-9及其mRNA相对含量比较Tab.3 Comparison of bronchial morphology,SLPI,MMP-9 in lung and the relative content of MMP-9 mRNA among four groups of rats ±s

与B组比较,*1P＜0.05;与A组比较,*2P＜0.05;与C组比较,*3P＜0.05Compared with group B,*2P＜0.05;Compared with group A,*1P＜0.05;Compared with group C,*3P＜0.05

组别大鼠/只管壁厚度平滑肌层厚度(μm2·μm-1) SLPI阳性系数MMP-9阳性系数MMP-9mRNA相对含量A组1017.6±2.6*111.8±4.3*13.91±0.32*11.80±0.19*11.498±6.370*1B组736.3±5.8*223.7±3.7*21.12±0.19*23.82±0.31*212.440±9.940*2C组927.4±6.1*1*218.5±4.1*1*22.11±0.26*1*23.09±0.28*1*29.616±10.560*1*2D组824.7±7.3*1*2*314.3±5.1*1*2*32.95±0.28*1*2*32.41±0.22*1*2*36.156±8.860*1*2*3

2.7 大鼠肺组织中MMP-9mRNA的表达 与A组比较,B组大鼠肺组织中MMP-9mRNA表达量明显增高(P＜0.05);干预组大鼠肺组织中MMP-9mRNA表达量明显比模型组降低(P＜0.05);干预组间比较,D组差异明显(P＜0.05),见表3。

3 讨论

香烟及反复呼吸道感染是COPD发生、发展的主要危险因素,笔者采用烟熏加气管内注射LPS法复制COPD模型,结果模型组大鼠出现呼吸急促,口唇四肢发绀,肺功能FEV0.3/FVC明显降低,光镜下支气管明显狭窄,支气管平滑肌增厚,BALF中有大量炎性细胞浸润,肺泡间隔断裂,部分融合成肺大泡,说明模型复制成功[9]。

本研究发现,模型组大鼠TGF-β1、MMP-9的表达明显增高,而SLPI水平显著降低(P＜0.05);且MMP-9水平与肺功能FEV0.3/FVC改变呈负相关(r=0.861 3,P＜0.01),结果与多数学者报道一致[10],而SLPI水平则相反(r=0.832 1,P＜0.01),提示上述细胞因子在COPD气道重塑的发生、发展中起重要作用。TGF-β1不仅促使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,增加纤维黏蛋白和胶原的合成,并抑制胶原酶和蛋白酶的产生以减少胶原降解,导致气道纤维化及重塑。研究发现, TGF-β1升高程度与病情严重性呈正相关,并上调转录因子Ets-1刺激MMP-9表达和分泌增加,加重气道重塑。MMP-9作为蛋白水解酶,几乎可降解所有的细胞外基质,COPD时使胶原的合成和降解失衡,导致肺基底膜结构破坏,同时大量炎性细胞可穿透破坏的基底膜屏障进入肺间质和肺泡,释放炎症因子,使肺部炎症迁延不愈,最终加重气道重塑。SLPI是气道内重要的保护基质,具有抗炎、抗真菌活性,并能降低NF-κB与基质金属蛋白酶的活性,中断炎症循环,从而减轻气道重塑。

COPD是一种伴有组织损伤与修复的慢性炎症,慢性炎症在COPD发病机制中起核心作用。目前认为,气道重塑的形成与小气道慢性炎症有密切的关系,这就提示抗炎类药物可以用于防止气道重塑。舒利迭是沙美特罗和丙酸氟替卡松的复方制剂,可作用于气道炎症及重塑的不同环节,不仅能抑制多种炎性细胞的活化及炎性因子的生成,并产生至少持续12 h的支气管扩张作用[11],还可降低血管的通透性,增强黏液纤毛的清除能力,预防气道重塑。并且在某些环节上更具有协同作用,丙酸氟替卡松能减少β2受体的脱敏和耐药性,沙美特罗通过使糖皮质激素受体磷酸化,使受体对类固醇的刺激更敏感,进而增强抗炎、减轻气道重塑效能。

本研究结果显示,经舒利迭干预后,C、D组大鼠肺组织炎性细胞数、小支气管管壁及平滑肌厚度明显减少,TGF-β1、MMP-9的表达显著下降,而SLPI水平明显升高,说明ICS/LABA对COPD肺组织破坏及气道重塑有很好干预作用。但C、D两组相比,差异明显(P＜0.05),说明不同剂量疗效不同,高剂量ICS/LABA优于低剂量,提示高剂量ICS/LABA不但能更好地改善肺功能、抑制肺部炎症递质的释放,还可改善气道重塑和肺纤维化程度,其机制可能与抑制支气管肺组织的炎症水平,进而降低TGF-β1、MMP-9的表达,并提高SLPI的水平有关。ICS/LABA已应用于临床,本实验为其抗气道重塑作用提供了新依据,但确切疗效仍需大量临床试验予以证实。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.012

Effects of Salmeterol/fluticasone Inhalant on the Airway Remodeling of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Rats

JIN Ming-Zhe,XIONG Ying
(Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China)

Objective To evaluate the effect of different doses of salmeterol/fluticasone(LABA/ICS)inhalant on the airway remodeling of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)in rats and its possible mechanism.MethodsForty Wistar rats were divided into four groups:the control(group A),the model(group B),the low dose of LABA/ICS(groups C),and the high dose of LABA/ICS(group D).Rats were exposed to cigarette smoking daily and intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS)twice daily to establish the COPD model.LABA/ICS was inhaled to the rats of COPD models for 30 days in groups of C and D.The pathological changes in lung were observed and spirometry function was detected.The expression of TGF-β1in BALF was tested by ELISA.The expression of MMP-9 and SLPI in lung was determined by immunohistochemistry.The expression of MMP-9 mRNA in bronchi and lung was assessed by RT-PCR.ResultsThe inflammatory cells infiltration,alveolar wall damage,bullae formation in lung and thickening of trachea wall and smooth muscle were found in group B,but less obvious in group C and D.Compared to group A,group B had higher expression of MMP-9 and TGF-β1level,but lower SLPI(P＜0.05).After intervention with ICS/LABA,both MMP-9 mRNA expression and TGF-β1level were dramatically decreased,but SLPI was increased in group C and D compared with group B(P＜0.05).The TGF-β1,MMP-9 and its mRNA in group D[(82.06±4.43),(2.41±0.22),(6.156± 8.86)]were lower than group C[(118.59±5.28),(3.09±0.28),(9.616±10.56)],the SLPI(2.95±0.28)was much higher than group C(2.11±0.26).ConclusionICS/LABA inhibits the airway wall remodeling of the COPD rats in a dose-dependent manner,which may be associated with upregulation of TGF-β1and MMP-9 expression and elevation of SLPI.

Salmeterol/fluticasone inhalant;Lung diseases,obstructive,chronic;Transforming growth factor beta1; Matrix metalloproteinase-9;Secretory leukocyte proteinase inhibitor

R974.3;R965

A

1004-0781(2014)03-0318-05

2013-05-02

2013-06-25

金明哲(1988-),男,吉林梅河口人,医师,硕士,主要研究COPD的基础与临床。E-mail：378420578@qq.com。