pH敏感脂质体在药物传递系统中的应用

曾慧琳，王姗姗，符旭东

(1.广州军区武汉总医院药剂科，武汉 430070;2.湖北中医药大学药学院2012级研究生班，武汉 430065)

·药学进展·

pH敏感脂质体在药物传递系统中的应用

曾慧琳1，2，王姗姗1，2，符旭东1

(1.广州军区武汉总医院药剂科，武汉 430070;2.湖北中医药大学药学院2012级研究生班，武汉 430065)

近年来,pH敏感脂质体研究取得显著进展。该文从pH敏感脂质体结构、特点、释药原理、构建以及作为载体的应用等方面进行综述,以期为pH敏感脂质体的应用和研究等提供参考。

pH敏感脂质体；载体；释药原理

近年来,随着对脂质体关注的增加,对其进行表面修饰,产生了pH敏感脂质体,这不仅弥补了常规脂质体的缺点,提高了脂质体的靶向性,还促进药效的充分发挥并提高基因的表达水平,在药物传递系统中具有良好的应用价值。本文对pH敏感脂质体的结构、特点、释药原理、构建以及其作为载体的应用等方面展开简要论述。

1 pH敏感脂质体的结构、特点以及释药原理

pH敏感脂质体(pH-sensitive liposomes)是一种对pH敏感的脂质体,其结构中的脂质双分子层的稳定性随环境pH变化而变化,同时也可称其为酸敏脂质体。在肿瘤间质液、局部缺血区域以及被感染或有炎症的区域,其pH比周围正常组织明显偏低,出现异常酸化现象,基于病变组织生理环境pH改变,研究者开发了pH敏感脂质体[1]。

目前研究的pH敏感脂质体主要集中于两大系统,第一大系统是采用pH敏感性类脂组成,第二大系统则是采用pH敏感性的聚电解质结合在脂质体的表面而形成[2]。pH敏感脂质体在pH=7.4中性环境时结构稳定,而在pH较低的酸性环境下,可使脂肪酸羧基质子化,进而引起六方晶相(H11相)的形成,促使其膜相互融合来释放药物[1,3]。在细胞内酸性条件下,即pH由中性降到酸性的时候,pH敏感脂质体膜的结构变成疏松的六方晶相,脂质体和溶酶体膜/核内体膜相互快速融合,将膜吸附、膜嵌入或者包封的物质输送到主动靶向的病变组织[3](图1)。由此可见,pH敏感脂质体不仅能够一定程度上减少溶酶体中的酶对药物的降解,还能使内容物的稳定性和摄取量提高,将药物有效地转运到胞质及病变组织中[4]。

图1 第一类pH敏感脂质体的释药原理A.在pH降低成酸性时,即H+增加时,脂质双分子层转变为六方晶相(H11相)。B.pH敏感脂质体变为六方晶相(H11相)后不稳定,脂质体膜和内体膜相互融合被促进,将内容的药物输送到病变组织(图片来源:Advanced Drug Delivery Reviews,2010,62(4): 576-588.)

而第二类pH敏感脂质体即具有聚电解质如聚乙基丙烯醇(poly ethyl ellyl alcohol,PEAA)等的脂质体,当pH发生变化时,这种连接于双分子层上的聚电解质链的构象也将发生变化,从而引发脂质双分子层结构重排,继而将内容物快速并定量地释放出来[5](图2)。

图2 第二类pH敏感脂质体的释药原理(在酸性环境下,双分子层上聚电解质链构象发生改变,脂质体稳定性受到破坏,其内容物被释放出来,图片来源:药学学报, 2009,44(5):519-524.)

2 pH敏感脂质体的构建

2.1 pH敏感性化合物与脑磷脂组成的pH敏感脂质体 早期pH敏感脂质体的研究主要通过选择不同磷脂来实现脂质体pH敏感性。这种pH敏感脂质体主要由pH敏感性化合物以及不饱和脑磷脂(unsaturated phosphatidylethanolamine,PE)组成的。其中常用于制备的不饱和脑磷脂是二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine,DOPE)[6]。而pH敏感脂质化合物的亲水部分含有pH敏感性基团,这些基团多含有羧基,如油酸(oleicacid,OA)、胆固醇半琥珀酸酯(cholesteryl hemisuccinate,CHEMS)和棕榈酰同型半胱氨酸(N-Palmitoyl homocysteine,PHC)等[7]。不饱和脑磷脂为圆锥形,头小身大(即亲水端小亲油端大),而pH敏感脂质化合物的羧酸基在中性条件下,为倒圆锥形,头大身小(即亲水端大亲油端小),于是两者互补形成了脂质体双层膜并稳定的在于中性环境。当pH降低为酸性时,羧酸基将会发生质子化,亲水端体积将会相对减小,于是在立体构象上不能与不饱和脑磷脂互补,从而导致脂质体不稳定[8]。各种不同的pH敏感的脂质体可以通过调节脂质的组成比例或者改变膜材种类而获得[9]。

CHO等[10]采用不饱和脑磷脂和pH敏感性化合物制备表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向pH敏感长循环免疫脂质体,用荧光钙黄绿素从脂质体的泄漏率评价pH敏感性,当DOPE/CHEMS为6∶4时,所得脂质体在pH=5.5时显示出较强的酸敏性,将吉西他滨封装于所得pH敏感脂质体中,其抑制癌细胞增殖的作用为游离药物的2倍。采用pH敏感性化合物和脑磷脂制备的脂质体实现了制备pH敏感脂质体的初步设想,也是现在最常见的用于构建pH敏感脂质体的方法。

2.2 pH敏感性蛋白与多肽修饰的脂质体 将融合肽或者融合蛋白插入磷脂双层是pH敏感脂质体的另一种制备方法。病毒膜上有一种特殊的蛋白使其能以融合的方式进入靶细胞,这种蛋白在pH酸性环境下结构发生改变活化。基于病毒蛋白的原理,用pH敏感性蛋白与多肽修饰脂质体,pH=7.4时,此类pH敏感性蛋白或者多肽将不会活化,在pH降低为酸性时,此时的pH敏感性蛋白或者多肽的结构将会随之发生改变,促进脂质体膜和细胞膜的相互融合,使此方法构建的pH敏感脂质体中的内容物被释放。

SOSUNOV等[11]将pH(低)插入肽[pH(low)insertion peptide,pHLIP]来修饰脂质体,以心肌缺血小鼠为模型(缺血区域的pH降低),经实验对比得知,pHLIP酸敏感脂质体在心肌缺血危险区域的平均荧光强度比正常心肌高,由此说明pHLIP酸敏感脂质体能靶向作用于心肌缺血区域,为今后治疗心肌缺血开辟了新途径。采用pH敏感性蛋白和多肽修饰的脂质体保留了蛋白的pH敏感融合的特点,扩展了pH敏感脂质体的设计和制备方法,但pH敏感多肽和蛋白在修饰了脂质体后仍会存在免疫活性,所以如何克服这一问题成为今后研究的重点。

2.3 pH敏感性高分子材料修饰的脂质体 pH敏感性高分材料子可以用来构建pH敏感脂质体,主要分为含有氨基和含有羧酸基的高分子材料两类。常通过将pH敏感性高分子材料修饰在脂质体外表面或者镶嵌在脂质体双层膜内而得到pH敏感脂质体,这类材料制得的脂质体其融合性能和pH敏感性都较高。具有氨基高分子材料如聚组氨酸和聚赖氨酸,需要与负电荷脂质体的相融合才能构建pH敏感脂质体。将羧酸基和亲油基团引入聚乙二醇高分子修饰在脂质体外表面也可制成pH敏感脂质体。

有学者通过高分子插入方法,采用被脂肪酰胺修饰的聚2-乙基丙烯酸pH敏感性高分子材料修饰而得到了pH敏感脂质体,并对制成的pH敏感脂质体的释药性能进行实验[12]。结果,当pH为中性时较稳定,当pH=5时80%荧光钙黄绿素从脂质体中释放,由此证明此方法所构建的pH敏感脂质体的pH敏感性较灵敏且具有较高的融合性。采用pH敏感高分子材料修饰的脂质体制备方法可控性较好,释药性能良好且简便,将成为pH敏感脂质体研究中的重点。

3 pH敏感脂质体作为载体的主要应用

3.1 pH敏感脂质体作为抗肿瘤药物的载体 当肿瘤组织局部缺血时,肿瘤间质液区域内的pH为5.0～6.5,低于正常组织,呈现酸化,pH敏感脂质体作为载体可以将药物释放到靶向部位。

为减少顺铂(cisplatin,CDDP)的毒副作用,提高药物生物利用度和靶向性,LEITE等[13]研究开发了长循环和pH敏感脂质体顺铂(long-circulating and pH-senstive liposomes containing cisplatin,SPHL-CDDP)。其中脂质体是由DOPE、CHEMS和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(distearoryl phosphatidyl ethanolamine-polyethy leneglycol 2000,DSPE-PEG2000)组成,在pH为酸性的部位,如肿瘤部位,CHEMS质子化,脂质体释放出药物。采用瑞士雌小鼠,用艾氏腹水瘤细胞通过腹膜内途径接种造模,经实验研究,SPHL-CDDP通过静脉给药,与普通CDDP给药相比,小鼠肿瘤生产抑制率增加,同时能显著降低肾毒性,长循环pH敏感脂质体作为抗肿瘤药物的载体,可以更好地改善CDDP疗效并减少毒副作用。

3.2 pH敏感脂质体作为基因的载体 相对病毒载体,pH敏感脂质体有低免疫原性、低细胞毒性、容易制备而且能容纳较大的目的基因,体现出其作为基因载体的优势[14]。

将基因包封于普通的脂质体中,在溶酶体中其基因片段容易被酶降解,不能发挥生物学效应。而pH敏感脂质体可以克服传统脂质体的这一缺点,能够避免基因片段被降解,增加包封物稳定性,将其转运至细胞质。由于正负电荷相吸的原理,常用阳离子脂质体作为基因载体,但阳离子脂质体在体循环过程中不稳定,容易引起较大细胞毒性。而pH敏感脂质体由于表面带负电荷,将不会和血液中糖蛋白及聚阴离子一些等带有负电的离子相互作用,相对于阳离子脂质体而言具有较低的细胞毒性和较高的稳定性。

SHI等[15]研究了叶酸受体(folate receptor,FR)靶向的pH敏感脂质体和阳离子脂质体的复合物在细胞内基因的表达,将叶酸-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺连接于制备好的抗血清pH敏感脂质体上。结果显示,FR靶向的pH敏感脂质体包裹的阿糖胞苷,相对非pH敏感脂质体而言增加胞浆残留的钙黄绿素的释放,使KB细胞的半数抑制浓度下降,是高效的基因传递载体。

王弘等[16]针对作为基因载体的pH敏感脂质体的制备方法及处方筛选方面做了研究,目的是探寻高基因转染率的酸敏脂质体的制备方法及最优处方,实验以组成比、pH及制备工艺为3个因素,以基因转染荧光测定值作为指标,运用正交设计法得到DC-胆固醇和大豆磷脂(soyabean lecithin)为4∶6的组成比,pH为5.4时并用减压蒸发-超声波分散法制得的pH敏感脂质体的测定值最高。

3.3 pH敏感脂质体作为寡核苷酸的载体 目前有学者利用阴离子pH敏感的融合脂质体对反义寡核苷酸进行包裹,进而通过内吞进行递送,在pH低的酸性环境下结构不稳定,引发脂质体膜和内体膜相融合,将内容物寡核苷酸(ologonucleo-tides,ODNs)释放到细胞质,避免被核酸酶降解,从而发挥其生物活性[17]。有学者通过实验研究发现,游离型ODNs使细胞摄取的量相对于pH敏感脂质体作为抗-myb寡核苷酸载体而言低3～5倍,这是由于pH敏感免疫脂质体作为载体能增加ODNs在人淋巴白细胞及骨髓内的转运[18]。

LUBRICH等[19]做了关于pH敏感脂质体作为反义寡核苷酸的载体来抑制星形胶质细胞中肌醇的摄取方面的研究,结果封装成反义寡核苷酸pH敏感脂质体与游离的反义寡核苷酸相比明显增加抑制肌醇的摄取,且达到50倍,因此应用钠肌醇协同转运蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter,SMIT)在pH敏感脂质体包裹反义寡核苷酸来阻断SMIT活动比游离的反义寡核苷酸更有效。由此可见,pH敏感脂质体作为寡核苷酸类的载体,能够在实验中明显地发挥其生物活性。

3.4 其他 MORILLA等[20]就将pH敏感脂质体作为抗寄生虫药物依他硝唑(etanidazole,ETZ)的载体,其中载药的pH敏感脂质体用胆甾醇半琥珀酸酯与二油酰磷脂酰乙醇胺以摩尔比4∶6制备。后以小鼠为模型对其抗克鲁斯锥虫的活性做了实验研究。结果发现,用ETZ pH敏感脂质体(ETZ loaded in pH-sensitive liposones,L-ETZ)能显著减少受感染小鼠的寄生虫血症水平,相对游离的ETZ抗寄生虫效果较好,在治疗抗寄生虫血病方面疗效显著。采用pH敏感脂质体作为载体能选择性地传递ETZ至吞噬细胞的细胞质中,由此实验研究可知,对于活性较差的药物可利用此方法来提高药物的疗效。

4 结束语

pH敏感脂质体是作为“智能型脂质体”,利用病灶处pH的变化,将脂质体的被动靶向性和细胞内pH的变化相结合,在中性pH条件下很稳定,当pH降低为酸性时,脂质体破裂或者融合来释放出其内容的药物,实现利用pH的变化而有针对性地释放内容物使药物到达靶向部位。随着近年来生物技术的不断发展,基因、核酸、多肽、蛋白质等大分子越来越多地被运用于疾病的治疗中,而pH敏感脂质体作为其良好的载体无疑将成为药物制剂研究领域的重点。然而,pH敏感脂质体的研究开发等方面还有很多待解决的问题,如靶向性、包封率和稳定性等。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.022

R94

A

1004-0781(2014)03-0348-04

2013-02-19

2013-03-20

曾慧琳(1990-),女,湖北武汉人,在读硕士,从事药物新剂型新技术研究。E-mail：baobao740240709@163.com。

符旭东(1969-),女,湖南沅陵人,硕士生导师,主任药师,从事药物新剂型新技术研究。E-mail：fuxudong2005@yahoo.com.cn。