虫草保元胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量测定

李兰茹，马慧萍，何蕾，董志臣，贾正平

(兰州军区兰州总医院药材科，全军高原环境损伤防治重点实验室，兰州 730050)

虫草保元胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量测定

李兰茹，马慧萍，何蕾，董志臣，贾正平

(兰州军区兰州总医院药材科，全军高原环境损伤防治重点实验室，兰州 730050)

目的 采用高效液相色谱法测定虫草保元胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量。方法色谱柱为Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇∶水(48∶52),检测波长:440 nm;柱温室温,流速: 1.0 mL·min-1。结果西红花苷-Ⅰ在6～45 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,r=1.000 0,平均回收率98.73%,RSD为1.24%(n=6);西红花苷-Ⅱ在3.2～24.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,r=1.000 0,平均回收率98.01%,RSD为1.53%(n=6)。结论该方法操作简便,测定结果准确,重复性好,可用于虫草保元胶囊的质量控制。

虫草保元胶囊；西红花苷-Ⅰ；西红花苷-Ⅱ；色谱法,高效液相；含量测定

虫草保元胶囊是我院自制中药复方制剂,由虫草、西红花、黄芪、麦冬等多味药材组成,具有益气养血、补益肺脾、补肾固精、养阴生津之功效。主要用于初入高原地区而致头晕头昏、心慌心悸、胸闷气短、腰酸腿困、疲乏无力、精神欠佳等,亦可作为保健应用。该方有抗疲劳、抗缺氧、抗衰老作用,能明显改善缺氧和疲劳不适,改善机体供氧状态,提高工作效率,增强学习记忆能力。西红花为方中君药,其主要有效成分为西红花酸和西红花苷,均具有多种药理作用,其中西红花苷主要由西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ和西红花苷-Ⅳ组成[1-3]。这些西红花苷是用于评价西红花质量优劣的指标性成分,2010年版《中华人民共和国药典》通过测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量来控制西红花的质量[4]。为更好地控制其内在质量,笔者选择处方中西红花作为研究对象,采用高效液相色谱法对其中的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ进行含量测定[5-6],为该制剂的质控标准提供方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 600-996型高效液相色谱仪,包括Waters 996光电二极管阵列检测器,Waters 600泵, Waters 600控制器;SK3300LH型超声清洗机(上海科导超声仪器有限公司);AE200电子天平(上海梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药 西红花苷-Ⅰ对照品(批号:111588-200501)、西红花苷-Ⅱ对照品(批号:111589-201103)由中国食品药品检定研究院提供,虫草保元胶囊(兰州军区兰州总医院生产,批号:20110401,20110402, 20110403),甲醇为色谱纯,其余为分析纯;水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(48∶52);流速:1 mL·min-1;柱温:室温;检测波长:440 nm,进样量:20 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取西红花苷-Ⅰ对照品和西红花苷-Ⅱ对照品适量,加稀乙醇分别制成每毫升含西红花苷-Ⅰ300 μg、西红花苷-Ⅱ160 μg的溶液,作为贮备液。临用时分别精密量取上述两种对照品溶液贮备液各1 mL,置10 mL量瓶,混匀,加稀乙醇稀释至刻度,即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品10粒,倾出内容物研细混匀,取约0.1 g,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加稀乙醇适量溶解,置冰浴中超声处理30 min,放置室温,加稀乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,用微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,即得[4]。

2.4 阴性样品溶液的制备 取除西红花外的其他处方量药材,按工艺制备方法制备成缺西红花的阴性样品,按上述供试品溶液制备方法制成缺西红花的阴性样品溶液。

2.5 系统适用性实验 分别取对照品溶液,供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL进样测定。在选定色谱条件下,西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰可达基线分离,分离度(R)＞1.5,理论板数按西红花苷-Ⅰ峰计算不低于3 500。样品色谱图与对照品色谱图一致,阴性样品在西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ色谱峰位置处无相应色谱峰出现,结果见图1。

图1 虫草保元胶囊高效液相色谱图A.阴性样品;B.对照品;C.供试品;1.西红花苷-Ⅰ;2.西红花苷-ⅡFig.1 HPLC chromatograms of chongcaobaoyuan CapsulesA.negative sample;B.regerence;C.sample solution;1.Crocin-Ⅰ;2.Crocin-Ⅱ

2.6 线性关系考察 精密吸取对照品溶液(含西红花苷-Ⅰ300 μg·mL-1和西红花苷-Ⅱ160 μg·mL-1) 0.2,0.4,0.8,1.0,1.2,1.5 mL分置10 mL量瓶,加稀乙醇稀释到刻度,摇匀,按上述条件测定。以西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的浓度为横坐标,峰面积值为纵坐标,经线性回归。其回归方程为A西红花苷-Ⅰ= 93 593C-4 681.7,r=1.000 0(n=6),结果表明西红花苷-Ⅰ在6～45 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。A西红花苷-Ⅱ=115 181C-4 665.1,r=1.000 0(n=6),结果表明西红花苷-Ⅱ在3.2～24.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.7 精密度实验 精密吸取“2.2”项混合对照品溶液20 μL,连续进样5次,结果西红花苷-Ⅰ峰面积积分值RSD=0.68%,西红花苷-Ⅱ峰面积积分值的RSD= 0.96%(n=5),说明精密度良好。

2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液(批号: 20110401),室温放置,20 h内每隔2 h进样20 μL,测定峰面积,西红花苷-Ⅰ峰面积积分值RSD=1.57% (n=6),西红花苷-Ⅱ峰面积积分值RSD=1.28%,表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.9 重复性实验 取同一批号(批号:20110401)样品,按“2.3”项方法制备6份供试品溶液,照高效液相色谱法,按外标法计算西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总量,平均含量11.35 mg·g-1,RSD=1.86%(n=6)。

2.10 加样回收率实验 称取已知含量的样品(含西红花苷-Ⅰ8.54 mg·g-1和西红花苷-Ⅱ2.82 mg·g-1) 6份,每份约0.05 g,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,精密加入西红花苷-Ⅰ对照品(浓度为0.456 mg·mL-1)和西红花苷-Ⅱ对照品(浓度为0.152 mg·mL-1)各1.0 mL,按样品制备方法制得加样回收实验的供试品溶液,进样20 μL,依法测定,计算回收率。结果见表1。西红花苷-Ⅰ平均回收率98.73%,RSD=1.24%;西红花苷-Ⅱ平均回收率98.01%,RSD=1.53%。见表1。

2.11 样品含量测定 按上述色谱条件和方法测定3批样品中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量,结果见表2。

3 讨论

西红花又称藏红花、番红花,是鸢尾科番红花(Crocus sativusL.)的干燥柱头,属名贵药材。其主要活性成分是西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ等苷类成分,但二者性质很不稳定,见光易降解,影响了含量测定结果的准确度,因此实验中供试品溶液的制备采用棕色量瓶[7]。

表1 西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ加样回收率测定结果(n=6)Tab.1 Result of recovery test of Crocin-Ⅰand Crocin-Ⅱ mg

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab.2 Content determination of samples mg

笔者在本实验对西红花样品和西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品溶液进行紫外扫描,找出西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ最大吸收波长,经综合考虑选择440nm作为检测波长。

实验首先按照《中华人民共和国药典》2010年版一部“西红花”含量测定所采用的甲醇-水(45∶55)为流动相[4],Hypersil ODS2 C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)为色谱柱进行实验,结果发现西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的出峰时间较晚。后通过反复实验调整,以Hypersil ODS2 C18柱为色谱柱,甲醇-水(48∶52)作为流动相,组合成的色谱条件对样品的分离较好,保留时间明显缩短(6～14 min),且能达到良好的基线分离,阴性无干扰,故确定选用此色谱系统。

虫草保元胶囊为我院自制制剂,其化学成分复杂多样,本实验采用高效液相色谱法同时测定西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ,结果表明该法操作简便,准确性好,灵敏度高,重复性好,结果稳定,可用于该制剂的质量控制。

[1] 李伟平,张云,丁志山.西红花的研究进展[J].北京联合大学学报:自然科学版,2011,25(3):55-58.

[2] 孙创斌,刘艳霞,刘国清,等.西红花苷的药理研究进展[J].西南国防医药,2011,21(8):914-916.

[3] 谭安雄,朱耀斌,王玉银.西红花酸对大鼠脑缺血-再灌注氧自由基及一氧化氮的影响[J].医药导报,2011,30 (7):846-848.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:120-121.

[5] 袁瑞瑛,欧珠罗布,江春艳,等.二十五味珊瑚丸中西红花苷Ⅰ&Ⅱ的含量测定研究[J].西藏大学学报:自然科学版,2012,27(11):36-39.

[6] 尼珍,阿萍,格桑索朗.HPLC法测定藏药二十五味珍珠丸中西红花苷Ⅰ的含量[J].药物分析杂志,2011,31 (1):151-153

[7] 何常明,谢晓梅,何美莲,等.西红花中西红花苷-1和西红花苷-2含量测定方法的建立[J].药物分析杂志,2006,26 (9):1270-1273.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.028

Content Determination of Crocin-Ⅰand Crocin-Ⅱin Chongcao Baoyuan Capsules

LI Lan-ru,MA Hui-ping,HE Lei,DONG Zhi-cheng,JIA Zheng-ping
(Department of Pharmacy,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Military Command;Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage,PLA,Lanzhou 730050,China)

Objective To establish a HPLC method for the content determination of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱinchongcao baoyuancapsules.MethodsThe HPLC method was carried out on a Hypersil ODS2 C18column(150 mm×4.6 mm, 5 μm),with methanol-water(48∶52)as the mobile phase,using the detection wavelength of 440 nm and the flow rate of 1.0 mL·min-1.ResultsThe calibration curves of crocin-Ⅰand crocin-Ⅱwere linear in the ranges of 6-45 μg·mL-1(r= 1.000 0)and 3.2-24 μg·mL-1(r=1.000 0),respectively.The average recoveries were 98.73%(RSD=1.24%,n=6)for crocin-Ⅰand 98.01%(RSD=1.53%,n=6)for crocin-Ⅱ.ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible, which is suitible for the quality control ofchongcao baoyuancapsules.

Chongcao baoyuancapsules;Crocin-Ⅰ;Crocin-Ⅱ;HPLC;Content determination

R286;R978.1

A

1004-0781(2014)03-0370-03

2013-06-05

2013-07-22

李兰茹(1969-),女,河北泊头人,主管药师,学士,主要从事药品检验工作。电话:0931-8994671,E-mail：13919271845@163.com。

贾正平(1957-),男,山西太原人,教授,博士生导师,主任药师,主要从事医院药学、临床药理和新药研究工作。电话:0931-8994652,E-mail：jzp2013@aliyun.com.cn。