多肽P161联合顺铂对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用*

张梦怡,郑恒,陈鹰,陈建华

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北中医药大学,武汉 430065;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉 430030;4.武汉凯泰新生物技术有限公司,武汉 430074)

多肽P161联合顺铂对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用*

张梦怡1,2,郑恒3,陈鹰1,陈建华4

(1.广州军区武汉总医院药剂科,武汉 430070;2.湖北中医药大学,武汉 430065;3.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉 430030;4.武汉凯泰新生物技术有限公司,武汉 430074)

目的 体外检测多肽P161联合顺铂(DDP)对多种肿瘤细胞增殖的抑制效应。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度DDP、P161单用及联合用药对人肝癌HepG2、人结肠癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782的生长抑制率。结果DDP和P161对多种肿瘤细胞均有剂量依赖性的抗增殖作用。联合给药组表现为协同效应,与DDP组比较差异有统计学意义(P＜0.05),在相同的抑癌效果下可降低DDP的使用量。且在相同浓度梯度下,联合用药组对Panc-1的抑制效果较差,而对MA-782效果最好。结论P161可以促进肿瘤细胞对DDP的敏感性,二者联合用药可降低DDP有效治疗浓度。

顺铂;多肽;抗肿瘤

20世纪80年代,人们发现一些肽能增加化疗药物的敏感性并且低毒,在维持相同化学治疗(化疗)疗效的同时能够减少化疗药物的剂量,继而降低毒副作用。G3BP是一种RasGAP SH3结构域段特异性结合蛋白,且在多种肿瘤组织和细胞中过量表达[1]。据此,本课题组合成得到一系列RasGAP SH3域段小多肽,分别研究它们的抗肿瘤活性,从中筛选到一个具有很强抑癌活性的多肽RasP161,定名为P161。前期研究证明,多肽P161能够增强铂类化疗药物抗结肠癌HCT116的活性[2-3]。为进一步评价P161的抗肿瘤活性,笔者选取人肝癌HepG2、人结肠癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法初步检测P161联合顺铂对上述5种癌细胞增殖的影响,为扩大其基础研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及实验器材 RPMI1640培养基(Hyclone公司,批号:NYA0785);0.25%胰蛋白酶、MTT试剂(Sigma公司,进口分装);顺铂(cisplatin, DDP,德州德药制药有限公司,批号:121102);二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amerisco公司,批号:120213);胎牛血清(杭州四季青公司,批号:120112); ELx800多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司);人肝癌HepG2、人结肠癌HT29、人前列腺癌IE8、人胰腺癌Panc-1及小鼠乳腺癌MA-782来源于武汉大学典型细胞库。

1.2 P161的合成 多肽P161纯度＞95%,相对分子质量为3 636.32。由武汉凯泰新生物技术有限公司利用氨基酸残基,运用芴甲氧羰基方法合成,高效液相色谱(HPLC)法纯化及分光仪检测,并保存于-20℃条件[4]。

1.3 受试药物的配制 多肽P161用去离子水配制成10 mmol·L-1的母液,筛孔内径0.22 μm的一次性滤头滤过后,置于-20℃下长期保存。

1.4 细胞抑制率的测定 取对数生长期的HepG2、HT29、IE8、Panc-1及MA-782细胞,进行消化离心,制成浓度为2.0×104个·mL-1的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200 μL。设不加细胞的空白对照组、阴性对照组(加入等体积的RPMI1640完全培养液)、DDP组、P161组及联合给药组(DDP+P161),每组均设3个复孔,放入5%二氧化碳(CO2)、37℃培养箱培养。待细胞贴壁24 h后,各实验组分别加入不同浓度的干预药物。使得DDP组的终浓度为5,10,20, 40,80 μmol·L-1;P161组终浓度为5,10,20,40, 80 μmol·L-1;联合用药组终浓度为5+20、10+20、20+ 20、40+20、80+20 μmol·L-1,放入培养箱中继续培养。24 h后取出培养板弃孔内液体,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,继续培养4 h。弃上清液,加DMSO 150 μL振荡10 min,使结晶物充分融解。用酶标仪在波长570 nm处测定各孔吸光度(A)值,并用空白对照组调零。每组实验重复操作5次,取其平均值。按下列公式计算细胞抑制率(IR),IR(%)= (1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。

1.5 统计学方法 全部数据用SPSS13.0版软件进行统计分析,结果用均数±标准差(±s)表示,多个样本之间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

DDP单用组,高浓度抑制率大于低浓度,呈明显的剂量依赖关系,差异有统计学意义(P＜0.05)。单用P161,除Panc-1细胞外,均有较好抑制效果,抑制率随其浓度增加而增加,呈明显的剂量依赖关系,差异有统计学意义(P＜0.05)。对IE8、HT29和MA-782细胞,单用P161在浓度＞40 μmol·L-1时,对肿瘤细胞的抑制率高于单用DDP组。联合给药组抑制率随DDP浓度增加而增加。在DDP浓度一定的条件下,对不同肿瘤细胞增殖的抑制率高于单用DDP组(P＜0.05)。除HT29细胞外,联合给药组在DDP用量为20 μmol·L-1时,对肿瘤的抑制效果就可达到单用DDP 80 μmol·L-1时肿瘤抑制效果。在相同浓度梯度下,联合用药组对Panc-1的抑制率明显低于其余4种细胞组(P＜0.01),而对MA-782抑制率最高。见表1。

3 讨论

针对癌症的治疗,临床主要采取手术切除、放射治疗(放疗)、化学治疗(化疗)以及靶向治疗的方式。其中,化疗在癌症的治疗中占重要地位。理想的化疗是对肿瘤细胞有选择性的杀伤,而对正常细胞无明显毒性,由于癌细胞与人正常组织细胞间缺乏根本性的代谢差异,使大部分化疗药物的选择性较差,毒副作用明显,治疗效果不尽如人意,非特异性化疗药物顺铂就是其中之一。前期证实G3BP与肿瘤细胞的多种生物学特性相关,是一种肿瘤标志物[5],因此笔者首次模拟并证实了G3BP的三维立体结构。基于该蛋白与其结合蛋白RasGAP的相互作用模式,运用分子动力学原理设计获得了一系列具特异性抗肿瘤活性的多肽,并结合多肽合成、细胞生物检测方法,设计合成并筛选出最具活性的抗肿瘤肽段。多肽P161就是以上述事实为基础合理设计筛选出来的。初期,王军等[6]对人脐静脉血管内皮HUVEC细胞进行相关研究,发现RasGAP SH3域段小多肽联合顺铂与单用顺铂对HUVEC细胞生长抑制率差异无统计学意义,说明其对人正常对照组织细胞毒副作用较小。

本研究结果显示,在设定药物浓度下,单用DDP和P161对肿瘤细胞均有一定的增殖抑制作用,且随药物浓度的增加,两种药物抑制肿瘤细胞增殖的效果也越明显,均呈明显的剂量依赖关系,但二者对不同癌细胞增殖抑制率差异无统计学意义。联合给药组对不同肿瘤细胞的抑制率明显高于相同浓度下的DDP组,说明P161很有可能是一种潜在的化疗药物增敏剂。值得注意的是联合给药组在保证抗肿瘤活性不变的前提下,减少铂类用药剂量,导致化疗毒性的减弱,因此有可能整体改善化疗的效果。此外,本实验还发现联合给药组对Panc-1的抑制作用最差,较其他4组比较差异有统计学意义。对MA-782的抑制作用最好。除实验误差外,可能与G3BP在乳腺癌、前列腺癌和结肠腺癌等肿瘤组织和细胞中过量表达有关[7-8]。

表1 不同浓度DDP和P161单用或联合使用对5类肿瘤细胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

表1 不同浓度DDP和P161单用或联合使用对5类肿瘤细胞的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of different concentration of DDP and P161 alone or jointly on five kinds of tumor cell lines %,±s

与DDP组同一浓度比较,*1P＜0.05;与其他肿瘤细胞比较,*2P＜0.01Compared with DDP at the same concentration,*1P＜0.05;compared with other tumor cell lines,*2P＜0.01

Panc-1MA-782 DDP组56.23±1.438.96±1.258.35±1.579.44±0.5519组别药物浓度/ (μmol·L-1)IE8HT29HepG2.67±1.65 108.95±1.6214.46±2.1012.81±1.5913.75±1.0028.87±0.40 2018.55±2.6026.68±0.9716.55±0.9616.72±1.1037.70±1.82 4021.04±2.4433.89±2.7735.18±8.0919.95±0.7849.07±0.69 8031.88±2.0943.92±1.4344.55±0.8824.77±0.7851.39±0.77 P161组53.97±1.153.80±1.057.19±1.723.74±0.8123.70±0.67 107.17±1.068.16±1.1114.53±1.378.89±1.5526.91±0.45 2017.15±1.7116.28±1.3617.32±1.3311.91±0.7136.13±0.93 4024.00±2.1836.57±1.1019.27±0.8314.63±0.6951.06±1.32 8039.91±2.3450.08±2.2232.32±8.8916.19±1.3063.67±4.08 DDP+P161组5+2023.24±2.03*117.90±2.35*117.73±1.36*113.99±1.13*1*239.49±1.15*110+2031.47±2.59*121.71±1.12*127.21±1.30*117.40±1.15*1*241.90±0.63*120+2038.53±2.17*128.88±0.89*141.51±1.21*124.22±1.66*1*259.45±0.39*140+2053.16±1.33*141.49±1.37*148.13±0.99*125.48±1.05*1*278.35±0.46*180+2075.99±2.19*159.23±0.56*151.61±2.30*128.01±0.62*1*286.54±1.23*1

综上所述,相比于P161和DDP单用,两药联合能提高肿瘤抑制率,但其与顺铂联用时引起细胞凋亡、发挥协同作用的具体作用机制尚不清楚,有待在整体动物的抗肿瘤药效和机制中进行进一步的确证。

[1] 张梦怡,陈鹰,陈建华,等.多肽P161联合顺铂对乳腺癌MA-782细胞株增殖和凋亡的影响[J].中国药师,2013, 16(12):1768-1771.

[2] ZHANG H,ZHANG S H,HE H,et al.P161 targets and downregulates G3BP to suppress cell growth and potentiate cisplaitin-mediated cytotoxicity to colon carcinoma HCT116 cells[J].Cancer Sci,2012,103(10):1848-1856.

[3] 张浩.以G3BP为潜在靶点的新型抗肿瘤药物研究[D].北京:北京协和医学院,2012:84-86.

[4] 陈建华,黄毅,熊骏宇,等.治疗或预防癌症的多肽或衍生产品及其应用:中国,200910163852.1[P].2009-08-11.

[5] 张浩,邵荣光.G3BP:一种潜在的肿瘤治疗靶点[J].药学学报,2010,45(8):945-951.

[6] 王军,谭诗云,陈建华,等.多肽P110结合顺铂对多种肿瘤细胞杀伤作用的研究[J].中国药理学通报,2011,27 (12):1728-1731.

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[8] GUITARD E,PARKER F,MILLON R,et al.G3BP is overexpressed in human tumors and promotes S phase entry[J]. Cancer Lett,2001,162(2):213-221.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.008

Inhibitory Effect of Polypeptide P161 Combined with Cisplatin on Proliferation of Multiple Cancer Cells

ZHANG Meng-yi1,2,ZHENG Heng3,CHEN Ying1,CHEN Jian-hua4
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China;2.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;3.Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;4.Wuhan Katy Gen Pharmaceuticals, Inc.,Wuhan 430074,China)

ObjectiveIn vitrodetection of anti-proliferative effects of P161 combined with cisplatin(DDP)on multiple cancer cells.MethodsGrowth inhibition rates of HepG2,HT29,IE8,Panc-1 and MA-782 treated by different concentrations of DDP,P161 and P161 combined with DDP were determined by MTT assay.ResultsDDP and P161 dosedependently inhibited proliferation of multiple tumor cells.A synergistic effect was found in DDP combined with P161 and there was a significant difference in the effect between DDP combined with P161 and DDP alone(P＜0.05).DDP dose could be decreased to reach the same inhibitory effect.In the same concentration gradient of DDP combined with P161,the inhibition rate of Panc-1 was low and that of MA-782 was high.ConclusionP161 can increase the sensitivity of tumor cells to DDP.The combination of P161 and DDP can reduce the effective therapeutic concentration of DDP.

Cisplatin;Polypeptide;Anticancer

R979.1;R965

A

1004-0781(2014)10-1288-03

2013-07-30

2014-03-23

*湖北省自然科学基金资助项目(2011CDB541)

张梦怡(1989-),女,湖北武汉人,药师,在读硕士,研究方向:肿瘤药理学。电话:(0)13207146089,E-mail:zmy422335@hotmail.com。

陈鹰(1971-),女,湖北武汉人,副主任药师,硕士生导师,博士,研究方向:生物药剂学。电话:027-87649309, E-mail:cy9262005@yahoo.com.cn。

陈建华(1965-),男,教授,博士,研究方向:生物化学与制药。电话:027-87690083,E-mail:jeff5ch@163.com。