响应曲面法优化多粘类芽孢杆菌HT16产生抗菌蛋白的培养基

韩俊华，陈大欢，黄继翔

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018;2.德州昂立达生物技术有限公司，山东德州253000)

近年来，为了最大程度的减少病虫害和农产品的经济损失，大量使用化学农药对农作物进行保护，由此引起的病菌抗药性、食品中农药残留超标、环境污染等问题日益严重。因此，消除与控制化学农药污染，开发利用与环境和谐的生物防治方法，进而保证食品安全和生态健康，已成为热点问题［1］。

葡萄白腐病多发于高温多雨季节，是引起葡萄烂果的主要病害之一，尤其是一些欧亚种品种，常引起大量果穗腐烂，对后期产量和果实的储藏销售影响较大。一般年份造成的损失在10%左右，严重年份高达60%以上［2－3］。多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，且细胞壁不含内毒素，对人畜无害在产品开发中活菌数量高、性能稳定，是一种理想的生防菌［4］，在工业生产和农业可持续发展中具有重要的应用前景。美国环境保护署2002年将它列为可商业应用的微生物之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。

多粘性芽孢杆菌HT16是从蝗虫体内分离到的一株能有效抑制真菌病害的生防菌。前期研究表明，HT16抑菌谱广泛，对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、葡萄白腐病、青霉等抑菌性明显，其发酵上清液经分离纯化后确定抗菌活性物质分子量在4500u左右，且对酸碱、紫外线和高温表现出很好的稳定性［5］。因此，HT16菌株及其发酵液在植物病害防治和采后防腐保鲜中具有很好的研究价值及开发前景。为了提高抗菌蛋白的产量和节约实际应用中的生产成本，本试验拟采用响应曲面法以葡萄白腐病菌作为指示菌对发酵培养基进行优化，以确定其产生抗菌蛋白的最佳经济型培养基。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 供试生防菌株为多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymaxa)HT16菌株，由本实验室保存，指示菌为葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodiella)由河北农业大学植保系提供。

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸镁、硫酸铵、磷酸氢二钾 均为分析纯试剂，天津市永大化学试剂有限责任公司;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 均为生化试剂，北京奥特星生物技术有限公司;黄豆饼粉和茯苓粉购于市场;YT－CJ－1N超净工作台 海博讯实业有限公司医疗设备厂;SPX－100B－Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SYQ－DSX－280B不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 山东新华医疗器械厂;pH211酸度计(Microprocessor pH Meter)HANNA instruments;3－18K高速冷冻离心机 SIGMA。

1.2 培养基

PDA培养基(种子培养基):葡萄糖2%、土豆20%、1000mL 蒸馏水，pH6.5。

发酵培养基:20%土豆、0.2%(NH4)2SO4、2.0%葡萄糖、0.05%K2HPO4、0.05%MgSO4·7H2O、pH6.5。

1.3 单因子试验

1.3.1 氮源单因子试验发酵培养基 分别以质量分数为0.2%的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、黄豆饼粉为氮源，代替(NH4)2SO4添加到发酵培养基［6］。

1.3.2 碳源单因子试验发酵培养基 分别以质量分数为2.0%的麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、茯苓、蔗糖为碳源，代替葡萄糖添加到发酵培养基［7］。

1.4 发酵条件

将50mL培养基装入250mL的三角瓶，121℃灭菌20min，将24h种龄的HT16种子培养基以体积分数为10%接种量转接到发酵培养基，置于30℃，186r/min的摇床内进行发酵培养，48h后对发酵上清液活性进行测定。

1.5 抗真菌活性的测定方法

采用杯碟法［8］进行抗真菌活性的测定，以无指示菌生长的区域的直径表示抗菌蛋白的产量。将150μL孢子悬液(105cfu/mL)均匀涂布于20mL PDA培养基上，并放置牛津杯，添加150μL/杯的发酵上清液(8000r/min，4℃下离心 10min)，再添加 20μL/杯的氯霉素抑制细菌的生长，将上述平板置于28℃，186r/min条件下培养48h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径(采用十字交叉法测量)。

1.6 试验方法

1.6.1 Plackett－Burman试验设计 通过单因子试验确定p.polymaxa HT16培养基的最适碳氮源，并根据芽孢杆菌生长特点添加一定的无机盐［9］。以Plackett－Burman设计法对试验的6个因素进行考察(见表1)，以抑菌圈直径为响应值作显著性分析。

表1 Plackett－Burman试验分析因素与水平Table 1 The factors and levels and of Plackett－Burman exprimental

1.6.2 最陡爬坡试验设计 根据Plackett－Burman得到的拟合函数，回归系数t的符号和大小来设计主要因素的最陡上升路径，如果t值为负则该因素水平应为递减，反之递增。通过响应值的大小变化找出峰值，从而找到最大响应区域［10］。

1.6.3 Box－Behnken试验设计 结合上述试验结果，根据Box－Behnken设计原理，以3个主要因素作为自变量(见表2)，以发酵液活性(即抑菌圈直径)为响应值进行优化，实验共设计17个试验点，其中12个分析因子，5个中心点。利用统计分析软件Design－Expert 7.1.3进行试验设计和数据分析［11］。

表2 Box－Behnken试验因素与水平表Table 2 Experimental factors and levels for the Box－Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 单因子试验

2.1.1 氮源单因子试验 分别以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、黄豆饼粉、(NH4)2SO4为初始氮源，结果表明5种氮源都能促进该菌的生长并产生活性物质。其中以酵母膏为氮源的培养基抑菌圈直径最大，但从成本角度来看，若进行大规模生产，(NH4)2SO4和黄豆饼粉为更经济的氮源，并且两种氮源协同作用优于单一碳源效果。

2.1.2 碳源单因子试验 以(NH4)2SO4作为氮源，分别以质量分数为2%的麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖、茯苓、蔗糖、葡萄糖为碳源，进行单因子试验。培养过程中各种培养基都有抗菌活性，但抑菌效果有所差别，结果如图2所示。可见蔗糖对抗菌蛋白的产生影响最大，所以本试验确定蔗糖作为培养基碳源。

图1 不同氮源对p.polymaxa HT16菌株产抗菌蛋白的影响Fig.1 The effects of different nitrogen source on HT16 strain produced antimicrobial protein

图2 不同碳源对p.polymaxa HT16菌株产抗菌蛋白的影响Fig.2 The effects of different carbon source on HT16 strain produced antimicrobial protein

2.2 Plackett－Burman试验对主要因素的筛选

通过单因子试验，上述原发酵培养基(即20%土豆、0.2%(NH4)2SO4、2.0% 葡萄糖、0.05%K2HPO4、0.05%MgSO4·7H2O、pH6.5)所得抑菌圈直径为12.07mm，芽孢数为1.8×108个/mL，并得到最初的发酵培养基为土豆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、黄豆饼粉六个培养基组分，对其进行考察，每个组分取高水平(+1)和低水平(－1)两个水平，测量发酵液抑菌圈直径大小，试验设计及结果分析见表3。

由表4可知，培养基组分对活性物质产量的影响显著性的排序为:土豆 ＞(NH4)2SO4＞蔗糖 ＞MgSO4·7H2O＞黄豆饼粉 ＞K2HPO4。结果显示，土豆、(NH4)2SO4、蔗糖为关键因素，其中土豆、(NH4)2SO4的t值为正，即对产抗菌蛋白的影响为正效应，蔗糖t值为负，呈负效应，且R2=0.97607，所以该模型拟合度较好。

表3 Placket－Burman设计与结果表Table 3 The Placket－Burman exprimental design and results

表4 各因素影响的主效应分析Table 4 The main Analysis of of various factors

2.3 最陡爬坡试验

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

2.4 Box－Behnken试验优化培养基成分

结合Plackett－Burman设计法筛选出的3个主要影响组分，根据它们的效应大小设计步长和变化方向，寻找产生最大活性值时的响应区域，试验设计及结果见表5。由结果可见，最大活性值在3号附近。

根据最陡爬坡试验结果，以试验号3的组分为响应面试验因素水平的中心点。采用Box－Behnken响应面试验设计确定主要因素的最优水平，试验设计及结果见表6。

利用Design Expert 7.1.3软件对表6进行多元回归分析，得到二次回归方程，即:

D=－13.68071+1.848X1+37.50950X2+3.08669X3－0.42750X1X2+0.03X1X3－3.9375X2X3－0.028240－23.395－0.82258。此模型的方差分析，见表7。

表6 响应面设计及对应结果Table 6 Results of response surface experiments

由表7可知，模型p＜0.0001，说明二次回归模型是显著的，失拟项p值为0.4552，说明该模型失拟项不显著，相关系数R2=0.9905，表明了响应模型可以解释99.05%的总体变异情况，只有0.95%的变异无法用模型来解释，回归模型有高度的相关性，可以应用于p.polymaxa HT16发酵培养基活性的理论预测。

表7 回归方程的方差分析Table 7 Analysis results of regression and variance

通过软件分析得到3种重要影响因子之间的响应面分析模型图(图3)。考察任意两个因子与响应面D值之间的关系可通过三维图形立体直观地表现出来。

图3 三个因素对抗菌蛋白产量影响的响应曲面图Fig.3 Response surface plot of the antifungal protein production by three main factors

由图3可知，3个响应面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值(抑菌圈直径)在试验变化范围内存在极高值。比较图3中的曲面图可知，培养基中土豆浓度(X1)对抗菌蛋白的影响最为显著，表现为曲线较陡。比较图3中的等高线图，土豆(X1)与硫酸铵(X2)质量浓度对HT16菌株抗菌蛋白产量的交互影响作用最为显著，表现为等高线最密集，与方差分析结果一致。对回归方程求极值得到p.polymaxa HT16最佳发酵培养基3个因素的含量分别为:土豆30.49%、0.4%(NH4)2SO4、蔗糖1.48%，预测最大值为24.248mm。

2.5 验证试验

为了检验模型的准确性，根据模型得到发酵培养基各组分的最适比例化整(即土豆30%、0.4%(NH4)2SO4、蔗糖1.5%)进行发酵试验，共进行3次平行验证试验。结果显示，抑菌圈直径分别为24.56、24.20和23.94mm，其平均值为24.23mm与预测值24.248mm相近，且试验芽孢数为4.5×108个/mL，比原培养基的1.8×108个/mL提高了2.5倍。

3 结论

本研究采用Plackett－Burman试验设计，对影响菌株p.polymaxa HT16代谢产生抗菌活性物质的6个组分进行了评价和分析，筛选出土豆、蔗糖、(NH4)2SO4为影响产量的主要因素。通过最陡爬坡试验确定最佳变化步长，得到最大相应区域。根据Box－Behnken响应面试验设计原理，确定了培养基的最优组分:土豆30%，1.5%蔗糖，0.4%(NH4)2SO4，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% 黄豆饼粉(中温)，pH6.5。发酵上清液的抑菌圈直径由原来的12.07mm提高到24.23mm，增加了1倍，且芽孢数提高了2.5倍，进一步提高了p.polymaxa HT16菌株的抑菌活性。

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