血小板聚集初期形状变化与聚集的关系及其影响因素分析

毛亚丽，韩纪举，王 云，常 欢，夏作理，赵晓民

(泰山医学院，山东泰安271000)

一般情况下，致聚剂会使血小板从静息状态的圆盘状变为球形(或带有伪足)，这种聚集初期的形状改变(变形)可导致GPⅡb/Ⅲa活化，引发聚集，因而变形是一种血小板活化的表现［1～3］。应用光学法血小板聚集仪检测时，聚集初期的变形表现为起始透光度降低［4～6］。由于聚集初期变形发生较快，该法比应用显微镜能更快、更准确地观察到变形。但在聚集初期血小板变形受哪些因素影响，以及与聚集的关系，少有研究。2013年5月～2014年1月，我们以起始透光度降低作为血小板聚集初期变形的指标，观察了动物和人、血小板体系、致聚剂对血小板变形的影响，分析聚集与变形之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 SPF级雄性SD大鼠，体质量240～260 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司;SPF级雄性昆明种小鼠，体质量18～29 g，由山东泰邦生物制品有限公司提供;健康成年男性，20～45岁，采血前2周均未服用任何药物。

1.1.2 主要仪器和试剂 720-2型血小板聚集仪购于美国Chrono-log公司，3K30型离心机购于美国Sigma公司，PE-6800VET型全自动血细胞分析仪购于深圳市普康电子有限公司;戊巴比妥钠购于Merck公司，二磷酸腺苷(ADP)、胶原购于美国Chronolog公司，纤维蛋白原(FIB)、三磷酸腺苷双磷酸酶(APY)和前列腺素E1(PGE1)购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)制备 小鼠和大鼠以腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，开胸心脏取血，肝素抗凝(40 000 U/L)，1 000 r/min 离心10 min，上清为 PRP;剩余部分以3 000 r/min离心10 min，上清为PPP。用21 G采血针于人肘正中静脉取血30 mL，ACD(2%葡萄糖、2.5%柠檬酸钠、1.35%柠檬酸)抗凝。1 100 r/min离心10 min，上清为PRP，PPP制备同上。

1.2.2 洗涤血小板制备［7，8］人 PRP中加肝素、APY、PGE1，2 200 r/min 离心10 min，分别用不同缓冲液洗涤血小板3次。首次为Tyrode液中加入肝素、APY、PGE1，第2次缓冲液中减肝素，第3次缓冲液仅用PGE1，最后将血小板悬浮于Tyrode液。

1.2.3 血小板聚集测定 血小板计数均调整为200×109/mL，温度37℃，搅拌子转速1 200 r/min，应用血小板聚集仪记录5～10 min聚集曲线，检测最大聚集率(%)。

1.2.3.1 人和小鼠、大鼠PRP的血小板聚集检测［9，10］以生理盐水(NS)调整PRP血小板数，同倍稀释 PPP作为聚集对照，加入 ADP(2.5×10-3mmol/L)5～10 μL检测。实验中2～3只小鼠PRP混合后测定。

1.2.3.2 人的两种PRP血小板体系聚集检测 取人PPP 17份，同一样本分2份，分别用PPP、NS稀释调整PRP血小板数，加入胶原(1×10-3g/L)5～10 μL 检测。

1.2.3.3 ADP和胶原在人两种血小板体系的聚集检测 实验分PRP组(用NS调整PRP血小板数)、洗涤血小板组(以Tyrode液调整血小板数)，同一个体(n=8)PRP要分别进入2组，并应用ADP(5×10-3mmol/L)5～10 μL和胶原(1×10-3g/L)5～10 μL检测。洗涤血小板聚集前(以Tyrode液调整血小板数后)加入FIB(0.1 g/L)5 μL。

1.2.4 血小板聚集初期变形测定［4～6，11］分组同聚集测定，根据聚集曲线，测定最大负值(加入致聚剂后出现的最大负值)、达最大负值时间(加入致聚剂后至出现最大负值的时间)。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据以±s表示，两组比较用t检验或非参数检验方法;用Pearson相关和多元线性回归法，分析聚集率与变形指标之间的关系。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期变形的比较 见表1。

表1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期变形的比较(±s)

表1 人和大鼠、小鼠血小板聚集率及聚集初期变形的比较(±s)

注:与小鼠比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01;与大鼠比较，△P ＜0.01

种属类型 n 聚集率(%)最大负值(-%)达最大负值时间(s)8 21.8±10.6 2.8±1.0 1.5±0.6大鼠 9 22.6± 5.8 3.4±0.8 11.4±4.7*人 9 23.6± 4.6 11.3±2.6#△ 7.3±4.0小鼠*

2.2 不同稀释PRP方法对血小板聚集率及聚集初期变形的影响 见表2。

表2 不同稀释PRP方法对血小板聚集率及聚集初期变形的影响(±s)

表2 不同稀释PRP方法对血小板聚集率及聚集初期变形的影响(±s)

注:与PPP稀释方法比较，*P＜0.05

稀释方法 n 聚集率(%)最大负值(-%)达最大负值时间(s)PPP 17 48.2±12.9 10.0±2.4 50.1±17.0 NS 17 52.0±15.8 8.4±1.7* 67.4±27.9*

2.3 ADP和胶原对血小板聚集率及聚集初期变形的影响 见表3。

2.4 聚集率与血小板聚集初期变形指标的关系将所有聚集实验作为一个整体(n=92)，相关分析显示，聚集率与最大负值、达最大负值时间呈正相关(r分别为0.49、0.48，P 均 ＜0.01)。

表3 ADP和胶原诱导血小板聚集初期变形的比较(±s)

表3 ADP和胶原诱导血小板聚集初期变形的比较(±s)

注:与ADP下同一底物比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与同一致聚剂下PRP比较，△P＜0.05，○P＜0.01

致聚剂 n 聚集率(%)最大负值(-%)达最大负值时间(s)ADP PRP 8 24.4±4.1 11.0±2.7 7.5±4.2洗涤血小板 8 22.6±3.2 1.3±0.5○ 4.2±1.6△胶原PRP 8 21.3±5.7 7.0±3.9* 17.3±4.4#洗涤血小板 8 24.0±9.5 2.3±0.6#△ 49.5±16.1#△

3 讨论

研究变形可应用EGTA抗凝，使血小板只出现变形而不聚集来开展［6，12］;但这种方法将变形和聚集分割开来研究，不能反映聚集过程中变形的改变以及对聚集的影响，因而研究聚集初期血小板变形对理解聚集更有意义。

本研究结果显示，聚集率与变形指标均正相关，表明血小板变形增加可使聚集增强。其中最大负值对聚集率影响最大，达最大负值时间较弱。为了在聚集过程中研究血小板的变形情况，本实验组间的聚集率保持基本相同。本研究观察了不同实验对象的血小板变形，结果显示人、大鼠、小鼠之间最大负值和(或)达最大负值时间有统计学意义，表明变形能力有种属差异;应用EGTA抗凝研究也表明，人和小鼠血小板变形不同。其中，人的最大负值是大鼠和小鼠的3～4倍，提示人比大鼠和小鼠血小板变形能力要强。因此，相关研究要注意实验对象之间血小板变形的差别。PPP和NS稀释PRP是聚集试验常用调整血小板浓度的方式，PPP稀释的血小板与体内环境基本相同。本研究结果显示，NS稀释后最大负值减小，达到最大负值的时间延长。表明NS稀释的血小板变形比PPP稀释的弱，提示血浆胶体渗透压成分对血小板变形有促进作用。洗涤血小板体系除血小板外，其组成为电解质和牛血清白蛋白。本研究结果显示，与PRP比较，应用ADP或胶原后，洗涤血小板变形均减弱。再次表明不同血小板体系影响变形，并提示血浆电解质和白蛋白不是影响变形的主要因素。此外，本研究结果显示，应用胶原后，在PRP中最大负值比应用ADP减小，达最大负值时间增大;在洗涤血小板中，最大负值、达最大负值时间比ADP均增大，表明在PRP中，ADP所致血小板变形能力强;在洗涤血小板重，胶原所致者强。提示不同致聚剂在不同血小板体系，导致血小板变形能力不同。同时还观察到，无论应用ADP或胶原，洗涤血小板比PRP血小板变形均减弱，再次提示血浆胶体渗透压成分对血小板变形的促进作用。

总之，血小板聚集初期变形促进聚集，人的比大鼠、小鼠增强，NS稀释PRP和洗涤血小板减弱，在PRP中ADP所致血小板变形能力强，在洗涤血小板中胶原所致者强。这对于研究血小板变形中选取实验对象、血小板体系和致聚剂以及相关结果分析提供了实验依据，也为从血小板体系中寻找影响变形的因素提供了参考，并为从血小板变形来调控聚集提供了思路。但其他致聚剂对变形的影响、相关干预药物的筛选以及有关信号通路的变化，还需进一步研究。

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