乌鲁木齐大气PM2.5对质粒DNA的损伤研究

苏都尔·克热木拉,胡 颖,迪丽努尔·塔力甫*,邵龙义,买丽克扎提·买合木提 (.新疆大学化学化工学院,新疆 乌鲁木齐 830046；.中国矿业大学资源与地球科学系煤炭资源与安全开采国家重点实验室,北京00083)

PM2.5能够通过呼吸等途径进入人体,并沉积在呼吸道甚至肺泡中.又因 PM2.5可以富集、携带多种致癌和有毒物质,如 PAHs、重金属元素等,对人体健康的危害非常大[1].到目前为止,关于大气颗粒物对人体健康的影响机制有许多假说,其中一种被广泛接受的观点是氧化性损伤假说,即颗粒物表面生物可利用的过渡金属离子会产生自由基,这些自由基是颗粒物产生氧化性损伤的主要原因[2-3].有研究表明,氧化性损伤是形成组织和器官纤维化的重要原因[4]和导致由吸烟引起的肺病如慢性阻塞性肺病,特别是肺气肿的原因一致[5].

质粒DNA评价法是一种定量测量活性氧对质粒DNA氧化性损伤能力的体外方法[6],其基本原理是颗粒物表面携带的自由基会对超螺旋DNA产生氧化性损伤,最初引起超螺旋DNA松弛,进一步使 DNA线化.这种损伤引起不同形态DNA在电泳仪中的运动速度不同,使这些 DNA从琼脂糖凝胶中分离开来.使用灵敏的显像测密术测量线状和松弛状(被破坏)的DNA占总DNA的比例,可以定量评价颗粒物对质粒 DNA造成的损伤.

目前用质粒DNA对颗粒物毒理方面的研究主要集中在北京、哈尔滨、澳门、郑州等城市[7-10],而对乌鲁木齐大气颗粒物研究还鲜见报道.乌鲁木齐位于亚洲中心,南邻塔克拉玛干沙漠,北邻古尔班通古特沙漠,市区三面被最高海拔高度为5000m 的天山围绕,而北面的通道却把准葛尔盆地的固体颗粒带入市区;在长达 6个月的采暖期有 1/3的时间都被雾霾天气所笼罩.在有关乌鲁木齐 PM2.5的研究中,对其生物活性研究还鲜见报道.因此,研究利用质粒 DNA评价法检测乌鲁木齐大气PM2.5对质粒造成破坏达到30%时所需要的颗粒物剂量(TD30),以揭示PM2.5对人体健康的影响,对认识乌鲁木齐大气 PM2.5的活性氧对人体健康的影响具有重要的意义,同时也可为乌鲁木齐大气颗粒物控制工作提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

高压灭菌的蒸馏水和 HPLC级水(Fisher,UK), X174-RF DNA(Promega,USA),溴酚蓝/丙三醇染色剂和 TBE(Tris-Borate-EDTA)缓冲液(Sigma,USA),琼脂糖(agarose),溴化乙锭(浓度为10mg/mL, AMRESCO,USA).

采样仪器由日本产 NL20型串级式大气颗粒物采样头、转子流量计、真空泵组成,采样滤膜为聚碳酸酯膜 (直径为:47mm;孔径为:0.6mm).

1.2 采样

采样点设在位于乌鲁木齐市的新疆大学(42°45′32″N～44°08′00″N,86°37′33″E～88°58′24″E)5号楼楼顶,空气入口与地面距离约为 15m.采样点距乌鲁木齐市主干道胜利路 200m,距新疆大学锅炉房 500m,后临家属院,左右邻教学楼,前200m范围为绿化地带.采样头设定流量为20L/min,时间设定为 24h.采样时间为 2012年 1月～12月,共采集样品44个.

滤膜放入恒温恒湿箱中平衡 24h.用十万分之一的精密电子天平(Sartorious CPA225D德国产)称重.采样后的滤膜恒温恒湿 48h,再次称重.通过差减法(采样后的滤膜质量减去采样前的滤膜质量)计算出颗粒物的质量浓度,具体采样信息如表1所示.

表1 PM2.5样品采集信息Table 1 Sample information of airborne PM2.5collected in Urumqi

1.3 质粒DNA损伤评价实验

根据颗粒物的质量加入适量的无菌水,将样品配成浓度为1000μg/mL的溶液,震荡20h左右,使样品上的颗粒物从滤膜上脱落下来.震荡结束,取出每个样品中的溶液将其分为两部分,一份(全样)放入冰箱待用,另一份在 13000r/min下离心 80min,取出上清液作为水溶样.全样和水溶样每个浓度等级的总体积为50μL,其中有1.8μL的DNA(按 2μL 算),7μL 的染色剂和 41μL(41μL 溶液体积=原始溶液体积+无菌水体积),每个样品预设定 1000,800,600,400,200μg/mL 5个浓度等级,原始溶液体积的计算公式为 1000×X=等级浓度×41.各样品准备 6个微量离心管(5个浓度等级再加1个超纯灭菌水样)编好顺序.离心管中首先加入1.8μL的X174-RF DNA(Promega,USA).再加入计算得到的原始溶液量.再加入计算得到无菌水.封口后在涡旋震荡器上轻轻震荡 6h.取出样品再在离心机中离心30min后,在每一个离心管中加入 7μL的溴酚蓝/丙三醇染色剂待用:将2.6g琼脂糖和 42mLTBE 缓冲液加到500mL的锥形瓶中,再加超纯灭菌水至 420mL,将锥形瓶放入微波炉加热至溶液完全清澈后取出,等待溶液冷却至 60℃左右时,向锥形瓶中加入10μL溴化乙锭后将锥形瓶中的溶液缓慢倒入放有 2个梳子的凝胶浅槽,每个梳孔中注入20μL样品、X174-RF DNA和染色剂三者的混合物,并在在电泳槽两端的溶液中各加 20μL溴化乙锭.在40V电压和30mA电流下通电16h后,使用紫外凝胶成像系统(英国Synoptics公司)对凝胶成像.再使用Syngene Genetools软件(英国Synoptics公司)对凝胶中不同形态DNA的光密度进行定量分析和统计(不同颗粒物剂量对DNA的损伤要减去H2O对质粒DNA的损伤),根据不同浓度等级颗粒物造成的 DNA损伤量进行线性回归,得出造成 30%DNA损伤的颗粒物的浓度,即TD30值.TD30值越小,则该颗粒物对质粒 DNA的氧化性损伤能力越强,对人体健康影响越大.实验过程在中国矿业大学煤炭资源与安全开采国家重点实验室(环境与健康实验室)完成.

2 结果与讨论

2.1 PM2.5质量浓度分析

由表 1可见采样期间,乌鲁木齐大气 PM2.5的质量浓度最大值为150.58µg/m3,出现在1月24日,最小值为 21.18µg/m3,出现在 5月 13日.1月24日是中国农历的大年初二,因为鞭炮燃放等原因造成当天的乌鲁木齐大气PM2.5的质量浓度最大.在全年采集的样品中 1/4样品的质量浓度高于或等于国家标准(75µg/m3).

就季节性分布而言(图 1),冬季(12、1、2月份)PM2.5质量浓的日平均值为 66.13μg/m3,春季(3、4、5月份)PM2.5质量浓的日平均值为60.85μg/m3,夏季(6、7、8 月份)PM2.5质量浓的日平均值为 45.91μg/m3,秋季(9、10、11月份)PM2.5质量浓的日平均值为 60.64μg/m3.可以得出 PM2.5的质量浓度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季的平均值差别不大.

图1 乌鲁木齐PM2.5的质量浓度的季节性变化Fig.1 Seasonal variation of mass concentrations of PM2.5 in Urumqi

由于乌鲁木齐雾霾天气主要集中出现在冬季,使得大气光照较弱、日照时间短、逆温出现频率增大、大气对流不活跃等不利于空气中污染物质扩散的因素较多,从而导致颗粒物浓度较高.而 6～8月是较典型的夏季季节,温暖、湿润雨量充滞,雨水的冲刷及其他气象因素使得大多时候空气的质量较好[11].

2.2 PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤

2.2.1 不同季节 DNA 的氧化性损伤 乌鲁木齐大气不同季节 PM2.5全样和水溶部分的 TD30值如表2所示.

表2 乌鲁木齐市PM2.5样品的全样和水溶部分的TD30值(μg/mL)Table 2 TD30 of whole sample and corresponding watersoluble fraction of PM2.5 collected from Urumqi in different seasons (μg/mL)

由表2可见,同一采样点不同季节不仅TD30值差异较大,而且全样和水溶部分对质粒 DNA的氧化性损伤也有差异.全样对质粒 DNA的氧化性损伤出现冬季最大,春季和夏季次之,秋季最低的季节性变化特征.

冬季 PM2.5全样和水溶部分样的 TD30值的平均值分别为 440,474μg/mL,最低可以观测到的值分别为35,43μg/mL;秋季全样和水溶部分样的平均值分别为535,600μg/mL;春季平均值分别为491,721μg/mL;夏季平均值分别为 503,666μg/mL.可以看出,乌鲁木齐大气 PM2.5无论是全样还是水溶部分样对质粒DNA的氧化性损伤均具有冬季最大,秋季最低的季节性变化特征.

造成这种季节性差异的可能原因是冬季静风频率高、逆温层厚、污染物较长时间不易扩散,再加上燃煤、汽车尾气等排放的大量燃煤飞灰和烟尘集合体长时间漂浮在大气中[12],吸附了大量的有毒有害物质,从而导致冬季 PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤较大.而乌鲁木齐秋季气候较干燥,风速较大,不利于污染物的聚集和有毒有害物质的吸附.

2.2.2 特殊气象条件下的PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤 表2中的样品5-26和6-13是在阵雨过后采集,因此,两个样品全样和水溶部分样的TD30值分别为 1620,247,1570,601μg/mL,即两个样品全样的 TD30值在所有样品中最大,对质粒DNA 的氧化性损伤最小.另外,两个样品全样的TD30值是水溶部分样的6.6和2.6倍,可能是由于降水的作用加速了大气中水溶性离子的形成使得吸附于颗粒相中的水溶性离子增多,而使得水溶部分样的TD30值小.

2.2.3 PM2.5全样和水溶部分对质粒DNA的氧化性损伤差异分析 一般认为,大气 PM10的肺毒性来自水溶组分[7].而Imrich等[13]研究指出,浓缩的大气颗粒物中的不可溶部分引起了肺泡巨噬细胞(AM)的生物反应.由图 2可见,2012年全年采集样品除以上两个特殊样品外,同一样品的全样和水溶样TD30值相差较大,绝大部分样品全样的 TD30值均小于水溶部分样的 TD30值,表示全样的毒性大于相应的水溶部分样.

图2 PM2.5样品的全样和水溶部分的TD30值Fig.2 TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction of PM2.5

2.2.4 TD30值与气象因素的相关性分析 为了探明气相因素(大气温度、湿度、风速)对 PM2.5氧化性损伤能力的影响,选用SPSS软件对PM2.5样品的全样及水溶部分的TD30值与气相因素之间进行了相关性分析,其结果如表3所示.

由表3可以看出,全样TD30值与平均温度在0.05水平上显著正相关,即采样时温度越高全样TD30值越大,全样的氧化损伤能力越小;但全样TD30值与平均风速、相对湿度之间没有相关关系;水溶样TD30值与平均风速和相对湿度之间的相关性概率P＜0.01,说明相关性非常显著,而且水溶样 TD30值与平均风速正相关,即风速越大TD30值越大颗粒物的氧化性损伤能力就越小;水溶样TD30值与相对湿度是负相关,及相对湿度越大TD30值越小,湿度越大颗粒物的氧化性损伤能力就越大.水溶样TD30值与平均温度之间没有相关关系.

2.3 TD30值与相应质量浓度的相关性分析

可吸入颗粒物的质量浓度不仅是流行病学调查研究的基础,也是目前空气质量的主要标准之一.从图 3可知,无论是全样还是水溶样的TD30与质量浓度之间没有明显的相关趋势.若颗粒物的质量浓度对氧化损伤起决定作用,那么应该 TD30值随浓度的增大而减少,但结果并非完全如此.

对全样来说,以样品 1-24和 12-30为例,当PM2.5的质量浓度高达 150.58µg/m3时,全样的TD30值高达 450μg/mL,即该样品氧化性损伤能力反而小;当 PM2.5的质量浓度等于 48.51µg/m3时,全样的TD30值为35μg/mL,表现出较大的氧化性损伤能力.而对样品 8-4来说,质量浓度只有24.3µg/m3,但其全样的 TD30值为 270μg/mL,样品2-28、4-11、10-2、11-1、12-24等均出现相似的情况.

表3 PM2.5全样和水溶样TD30值与环境因素的相关性Table 3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding environmental factors

图3 PM2.5全样和水溶样TD30值与其质量浓度之间的关系Fig.3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding Massconcentrations

就水溶样来说,以样品4-22、7-7和1-24为例.当 PM2.5的质量浓度等于 57.64µg/m3时,水溶样的TD30值为1758μg/mL,即该样品的氧化性损伤能力很小;当质量浓度等于34.38µg/m3时,水溶样的TD30值为69μg/mL,表现出较大的氧化损伤能力.对样品 1-24来说,其质量浓度高达150.58µg/m3时,水溶样的 TD30值只等于480μg/mL,其损伤能力居中.但也有部分样品出现质量浓度和TD30值成正比或成反比的情况,如样品1-4、1-11、1-21都是随着质量浓度的减少其 TD30值也减少,即氧化性损能力伤增大;而样品 1-31、2-1、2-14随着质量浓度的增大TD30反而减少,即氧化性损伤能力增大.因此仅以颗粒物的质量浓度来评价大气颗粒物氧化性损伤能力大小的方法并不能真实地反映其对人体健康的危害程度,其决定作用的还是颗粒物的化学组成及其表面吸附的有害成分[14].

3 结论

3.1 采样期间 PM2.5的质量浓度最大值为150.58µg/m3,最小值为 21.18µg/m3.2012年乌鲁木齐 PM2.5的质量浓度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季PM2.5的质量浓度差值不大.

3.2 PM2.5全样对质粒DNA的氧化性损伤冬季最大,春节和夏季次之,秋季最低;PM2.5水溶部分样对质粒DNA的氧化性损伤具有冬季最大、夏季次之、春节较低,秋季最低的季节性变化特征.绝大部分 PM2.5样品全样的的 TD30值小于水溶部分样的TD30值.

3.3 在阵雨后采集的两个样品的全样和水样分别 D30值分别为 1620μg/mL 和 1570μg/mL,明显大于相应的水溶部分的 D30值 601μg/mL、247μg/mL.

3.4 全样 TD30值与平均温度在 0.05水平上显著正相关,即温度越高全样 TD30值越大,氧化损伤能力越小.水溶样TD30值与平均风速在0.01水平上显著正相关,与相对湿度显著负相关,说明风速越大颗粒物的氧化性损伤能力就越小,湿度越大颗粒物的氧化性损伤能力就越大.

3.5 PM2.5的氧化性损伤能力与相应的质量浓度之间没有明显的相关性.

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