用在体皮肤微透析法研究黄芩苷凝胶经大鼠皮肤吸收的局部药动学

娄月芬，朱全刚，尤本明，李洁，顾小燕，张若曦(.上海市第一人民医院分院药剂科，上海 0008;.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学部，上海 0047;.第二军医大学附属长海医院药学部，上海 004)

·论著·

用在体皮肤微透析法研究黄芩苷凝胶经大鼠皮肤吸收的局部药动学

娄月芬1，朱全刚2，3，尤本明3，李洁3，顾小燕2，张若曦2(1.上海市第一人民医院分院药剂科，上海 200081;2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学部，上海 200437;3.第二军医大学附属长海医院药学部，上海 200433)

目的建立大鼠在体皮肤微透析技术，研究黄芩苷凝胶经皮吸收局部药动学。方法采用HPLC-MS/MS联用技术测定大鼠皮肤微透析液中黄芩苷的浓度。SD大鼠在麻醉状态下做皮肤微透析预处理，然后将黄芩苷凝胶涂于探针所在皮肤表面，收集皮肤微透析液样品进行黄芩苷浓度测定，绘制黄芩苷浓度-时间曲线，计算经皮吸收局部药动学参数。结果用于定量分析的离子对为m/z447.3→271.2，黄芩苷在检测浓度范围内线性关系良好，色谱的专属性、精密度等测定结果均符合生物样品测定要求。体内皮下探针对黄芩苷的回收率为(24.40±0.91)%，240 min内各取样点回收率保持稳定;黄芩苷经皮给药后8 h内微透析液中均可检测到黄芩苷的存在，且药物在皮肤组织内浓度持续升高，AUC0-t为(50.04±34.17)(mg·min)/L。结论

黄芩苷凝胶;微透析;经皮吸收局部药动学;大鼠

三黄膏是目前临床常用于疮疡初起、红肿热痛及轻度烫伤等症的外用复方中药制剂，由黄柏、黄芩、黄连及栀子与适宜基质组成，具有清热解毒、消肿止痛之功效。其中，黄芩是一味非常重要的中药，其主要成分黄芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗病毒、抗变态反应等药理活性［1］。在体皮肤微透析技术可以对实验动物或人体皮肤组织进行在体、连续的药物浓度测定，现已广泛用于外用制剂的在体经皮吸收动力学研究［2］。为进一步研究三黄膏经皮给药的体内过程，本研究将其主要活性成分黄芩苷制成外用凝胶，用在体皮肤微透析法研究黄芩苷经大鼠皮肤吸收的局部药动学。

1 材料

1.1 药物和试剂黄芩苷对照品(纯度98%，中国药品生物制品检定所，批号110715-201016);甲醇(色谱纯，美国Merck公司);蒸馏水(第二军医大学附属长海医院药学部);Veet脱毛膏(法国Veet公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器W201型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);PHS-3TC精密酸度计(上海天达仪器有限公司);DSHZ300多用途恒温水浴振荡器(江苏省太仓市实验设备厂);FA-2004万分之一电子天平(上海天平仪器厂);十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。MD1001灌注器推进泵、MD-1020-K四联流量控制器和容量为1 ml的灌注器(美国BAS公司);线性探针(膜长30 cm)。90-1型磁力搅拌器(上海振荣科学仪器有限公司)。G 6410A HPLCMS/MS联用仪(配有三重四级杆LC-MS系统、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自动进样器和G1316A柱温箱，美国安捷伦公司)。

1.3 实验动物雄性SD大鼠，体重约200 g，由第二军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号: SCXK(沪)2007-0003。

2 方法和结果

2.1 色谱条件XTerraR MS C18色谱柱(2.1mm× 150 mm，5μm，美国Waters公司);流动相:甲醇∶水(含2 mmol/L甲酸铵，用甲酸调节pH至3.5)= 85∶15;流速:0.4 ml/min;柱温:35℃;进样量:1μl。

图1 黄芩苷的的总离子流色谱图

2.2 质谱条件离子源为电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描方式及多离子反应方式(MRM)检测;干燥气(N2)温度为350℃，流速为10 L/min;毛细管电压为4 000 V;雾化压力为40 psi，裂解电压为122 V;检测时间3 min。在一级全扫描质谱图中获得黄芩苷的准分子离子峰为m/z447.3，选择性对其进行二级质谱分析，得到主要碎片离子为m/z 271.2，仪器自动优化相对碰撞能量为21 eV。将上述离子对用于定量分析。

2.3 微透析介质的配制分别称取无水枸橼酸0.73 g，二水枸橼酸钠2.2 g，无水葡萄糖2.45 g，依地酸二钠0.4 g，半胱氨酸0.2 g，溶解于蒸馏水中，定容至1 000 ml，用0.45μm的水系微孔滤膜过滤，即得微透析介质(pH 3.95)。

图2 黄芩苷的质谱图

2.4 系列浓度对照品溶液的配制精密称取适量黄芩苷对照品置于100 ml容量瓶中，用微透析介质溶解并稀释至刻度，配制成10μg/ml的黄芩苷储备液。依次精密量取该储备液适量，置于10 ml容量瓶中，用微透析介质稀释至刻度，摇匀，配制成2、5、10、20、50、100、200 ng/ml的系列浓度对照品溶液。

2.5 标准曲线的制备及方法学考察

2.5.1 标准曲线的制备精密量取系列浓度对照品溶液各1μl，分别进样测定，以黄芩苷对照品的峰面积Y对相应的浓度X(ng/ml)进行线性回归，得微透析样品标准曲线，回归方程为Y=14.11X-8.85(r =0.999 7)，线性范围为2～200 ng/ml。

2.5.2 方法专属性分别取大鼠腹部皮肤给予空白凝胶2 h、黄芩苷凝胶2 h后的皮下微透析样品进行HPLC-MS/MS分析，结果表明，空白凝胶给药后皮下微透析样品未见待测物本底以及其他干扰物质影响黄芩苷的测定。

2.5.3 精密度试验分别量取低(2ng/ml)、中(20 ng/ml)、高(200 ng/ml)3种浓度的对照品溶液，在1 d内测定黄芩苷浓度5次，得日内RSD分别为2.22%、0.26%、0.28%(n=5);连续进样3 d，得日间RSD分别为3.17%、1.20%、2.08%(n=5)，表明精密度良好。

2.5.4 稳定性试验采用微透析介质分别配制低(1μg/ml)、中(4μg/ml)、高(10μg/ml)3种浓度的对照品溶液，置于37℃水浴中加热24 h，适当稀释后进样测定，结果分别相当于配制浓度的103.88%、97.39%、97.98%，表明黄芩苷在透析及样品测定过程中稳定性好。

2.6 黄芩苷凝胶处方及制作方法

2.6.1 处方黄芩苷2 g，羟丙甲纤维素(HPMC E3-2V)10 g，聚乙二醇400(PEG 400)5 g，甘油20g，氮酮5 g，无水枸橼酸0.073 g，二水枸橼酸钠0.22 g，蒸馏水加至总量100 g。

2.6.2 制作方法取无水枸橼酸、二水枸橼酸钠溶于适量蒸馏水中，加入羟丙甲纤维素溶胀，备用;另取聚乙二醇、甘油、氮酮，加入黄芩苷，充分搅拌混匀得黄芩苷溶液，将此加入前述羟丙甲纤维素溶液，用蒸馏水补足至100 g，搅匀，即得凝胶。

2.7 实验动物处理取SD大鼠，体重约200 g，实验前1 d用脱毛膏去除腹部毛。实验前用25%乌拉坦溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉动物，将大鼠腹部朝上固定于保温垫上，使其体温维持在37.5℃左右。将2根线性微透析探针(膜长30mm，截留相对分子质量5 000)用18G穿刺针引导平行植入皮下后(间隔2 cm)，引导针抽回而微透析探针膜管留于大鼠皮下组织中，将探针连接于微透析装置。

2.8 大鼠体内黄芩苷回收率测定以微透析介质配制浓度为4μg/ml(Cperf)的黄芩苷灌流液，2只SD大鼠分别植入2根探针，灌注速度3μl/min，平衡90 min后，每20 min收集一次透析液，各收集12个样品，用HPLC-MS/MS测定药物浓度(Cdial)。根据公式［2］Rdial=(Cperf-Cdial)/Cperf计算黄芩苷的体内回收率为(24.40±0.91)%(n=4)，240 min内各取样点回收率保持稳定。

2.9 黄芩苷凝胶经皮吸收局部的药动学过程采用4只SD大鼠建立微透析系统，每只大鼠植入2根探针，用不含药物的微透析介质灌注探针90 min后，在透析窗正上方局部皮肤用2%黄芩苷凝胶1 g包封，平衡40min后，每隔20min收集1次透析液，收集8 h，用HPLC-MS/MS测定药物浓度(Cdial)，所测浓度经回收率校正后即为皮下组织中药物浓度(Ctiss=Cdial/Rdial)。该凝胶经皮给药后40 min至8 h内微透析液中均可检测到黄芩苷的存在，且药物在皮肤组织内浓度持续升高，AUC0-t为(50.04±34.17)(mg·min)/L。

图3 黄芩苷凝胶给药的大鼠皮肤药物浓度-时间曲线(n=8)

3 讨论

在体皮肤微透析样品体积小，所含药物浓度低，因此对分析方法的灵敏度要求很高。HPLC-MS/MS法具有高效、快速、灵敏度高、特异性强等特点，因而广泛应用于在体皮肤微透析样品的分析。探针植入皮下所造成的创伤十分轻微，但亦可产生红斑、引起组织中小分子物质浓度和组织血液灌流量的改变，从而影响研究结果。因此在探针植入后到局部给药前需有一段平衡时间，通常为60～90 min［2］。

在微透析取样方法中，探针回收率的准确校正是获得组织液内真实药物浓度的关键。李洁等［3］在前期研究中已采用微透析联用HPLC法测定透析液中黄芩苷的浓度，结果表明，随着流速增加，回收率降低，并且增量法和减量法测得的回收率随流速的变化趋势相对一致。用不同浓度的灌流液，黄芩苷回收率差异很小，表明灌流液浓度对黄芩苷的回收率几乎没有影响。在灌流液速度相同的实验条件下，增量法和减量法测定结果比较一致，即黄芩苷通过微透析膜不存在扩散方向依赖性。因此，本研究将微透析技术应用到黄芩苷的皮肤药动学研究时，采用减量法测定黄芩苷的体内探针回收率。

黄芩苷的稳定性受温度、pH值等多种因素影响，其稳定pH值范围为3～4［4］。本研究未采用李洁等研究中选择的PBS(pH 5.5)作为体内微透析的灌流介质。究其原因，在体内探针回收率研究过程中发现，在pH 5.5条件下，由于SD大鼠皮下生理条件的影响，微透析液中黄芩苷浓度很低，难以准确检测。在参考有关文献［5］的基础上，采用改良的枸橼酸葡萄糖抗凝溶液(anticoagulant citrate dextrose)作为微透析介质，内含有3.5 mmol/L枸橼酸、7.5 mmol/L枸橼酸钠、136.0 mmol/L葡萄糖及抗氧化剂0.02%半胱氨酸和0.04%依地酸二钠，此溶液中黄芩苷的稳定性满足分析要求，且在大鼠体内的探针回收率亦稳定。

从黄芩苷凝胶经皮给药局部药动学过程可以看出，黄芩苷能够较迅速透过皮肤，在实验的8 h内浓度持续增加，尚未达到最高浓度，下一步的研究中将延长实验时间。在实验过程中发现，黄芩苷凝胶的皮下浓度在各个探针和大鼠之间存在差异，其原因可能是各大鼠对药物的皮肤屏障作用以及皮肤代谢作用不一致，而非微透析技术自身缺陷所造成的。本研究成功建立了HPLC-MS/MS法检测大鼠皮下微透析样品中黄芩苷的含量，并考察了黄芩苷凝胶给药后皮肤局部组织的药动学过程，表明在体皮肤微透析法可用于黄芩苷经皮吸收局部药动学研究。

【参考文献】

［1］王雷，王学艳，周雪琴，等.黄芩苷凝胶设计与体外透皮性能的研究［J］.中草药，2008，39(10):1502-1504.

［2］陈芳，胡晋红，朱全刚.用微透析法测定氢溴酸东茛菪碱凝胶经皮给药大鼠体内药动学研究［J］.药学服务与研究，2012，12(4):270-273.

［3］李洁，朱全刚，尤本明，等.采用微透析联用HPLC法测定透析液中黄芩苷的浓度［J］.药学服务与研究，2012，12(1): 73-74.

［4］Xing J，Chen X，Zhong D.Stability of baicalin in biological fluids in vitro［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，39(3-4):593-600.

［5］Huang H，Zhang Y，Yang R，et al.Determination of baicalin in rat cerebrospinal fluid and blood usingmicrodialysis coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，874(1-2):77-83.

Study on local pharmacokinetics of baicalin gel after transdermal adm inistration in rats by skin m icrodialysis in vivo

LOU Yuefen1，ZHU Quangang2，3，YOU Benming3，LI Jie3，GU Xiaoyan2，ZHANG Ruoxi2(1.Department of Pharmacy，Branch of Shanghai First People＇s Hospital，Shanghai 200081，China;2.Department of Pharmacy，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200437，China;3.Department of Pharmacy，Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Objective Todevelop a novel skin microdialysis technology in vivo，and to determine the pharmacokinetic of baicalin after transdermaladministration in rats.MethodsAn HPLC-MS/MSmethod used for the determination of baicalin in skinmicrodialysis sampleswas established，SD ratswere pretreated with skin microdialysis operation under anesthesia，and then the baicalin gel was applied to the skin surface of probe in vivo.The baicalin concentration of skin microdialysates was determined，the time curve of baicalin concentration was drawn and the topical pharmacokinetics parameters of percutaneous absorption was calculated.ResultsBaicalin was optimized at the transitions m/z447.3→271.2.The linearity correlation was good and the assay exhibited good precision and accuracy.The subcutaneous probe recovery of baicalin in vivo was(24.40±0.91)%and was stable over the 240 min study period.Baicalin could be detected in the microdialysis samples after transdermal administration，and its concentration continued to rise in 8 h. AUC0-t in skin tissue was(50.04±34.17)mg·min·L-1.Conclusion Themethod of skin microdialysis in vivo could be used in the local pharmacokinetic research of baicalin.

baicalin gel;microdialysis;dermatopharmacokinetics;rat

R932，R943.43 ［< class="emphasis_bold">文献标志码］A

A

1006-0111(2014)06-0444-04< class="emphasis_bold">［DOI］ 1

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.011

2014-01-02

2014-09-03［本文编辑］陈静［收稿日期］2013-06-07［修回日期］2013-12-20［本文编辑］李睿旻

上海市卫生局课题(20114061);上海市教委预算内项目(2013JW51);上海市药理学会皮肤药理学专业委员会基金(No. 201302).

娄月芬，硕士，副主任药师.E-mail:louyuefen@sina.cn.

朱全刚，博士，副主任药师.E-mail:qgzhu@126.com.

在体皮肤微透析法可用于黄芩苷经皮吸收局部药动学研究。