一株鸭源性多杀性巴氏杆菌的分离和鉴定

刘爱武 耿 松

（沛县畜牧兽医站，江苏徐州 221600）

禽霍乱又称为禽出血性败血症或禽巴氏杆菌病，由多杀性巴氏杆菌引起[1]。多杀性巴氏杆菌病在鸭、鸡、鹅、火鸡等家禽中易发，尤其鸭易感，对未接种禽霍乱疫苗的鸭致病率很高，日死亡率可达10%以上。个别接种禽霍乱疫苗的鸭有时仍可以感染多杀性巴氏杆菌而发病。本病常呈现急性经过，发病率和死亡率均较高。2007年9月，沛县某养殖户共饲养麻鸭约1 000 只，38日龄，出现急性死亡，每天死亡达30只左右，持续3～4 d，用环丙沙星等药物无效。经做细菌分离和鉴定，依据药敏试验选择药物，病情得到了控制。

1 材料与方法

1.1 培养基

（1）麦康凯琼脂（Mackonkey agar，蛋白胨20 g，乳糖10 g，氯化钠5 g，牛胆盐5 g，中性红0.025 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水1 000 ml，pH7.3+0.2）。

（2）DHL琼脂（蛋白胨20 g，牛肉膏3 g，乳糖 10 g，蔗糖10 g，去氧胆酸钠1 g，硫代硫酸钠 2.3 g，柠檬酸钠1 g，柠檬酸铁铵1 g，中性红0.03 g，琼脂18～20 g，蒸馏水1 000 ml）。

（3）血琼脂（pH7.4～7.6豆粉琼脂100 ml，脱纤维羊血（或兔血）5～10 ml，加热溶化琼脂，冷至50 ℃，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板）。

1.2 试剂

（1）革兰氏染色液：

① 草酸铵结晶紫染液（A液：结晶紫（crystal violet）2 g，95%乙醇20 ml；B液：卢戈（Lugol）碘液（碘片1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 ml，先将碘化钾溶解于少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全部溶解后，加足水分即成）。

②95%的乙醇溶液。

③番红复染液（番红2.5 g，乙醇100 ml；取上述配好的番红乙醇溶液10 ml与80 ml蒸馏水混合均匀即成）。

（2）美蓝染色液（美蓝 0.3 g，95%乙醇，30 ml，0.01%氢氧化钾溶液，100 ml，将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合）。

1.3 药敏试纸

庆大霉素（10 μg/片）、四环素（30 μg/片）、磺胺异恶唑（300 μg/片）、痢特灵（300 μg/片）、左氟沙星（5 μg /片）、淋必治（壮观霉素）（100 μg/片）、头孢他啶（30 μg /片），购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 生化发酵管

葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、水杨苷、尿素、硫化氢、等微量生化发酵管，为杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.5 SPF鸡

SPF鸡由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室提供。

1.6 肝脏触片

取下肝脏，先用镊子夹持其中部，然后以灭菌的剪刀取一小块，夹出后将其新鲜的切面在玻片上压印，自然干燥，火焰固定，美兰染色，镜检。

1.7 细菌分离

将剪刀在酒精灯上灼烧后轻触肝、表面灭菌，剪刀再次消毒，剪开灭菌区的肝，用接种环插入肝组织内取样接种于血液琼脂平板上。在有氧的环境下，置于37 ℃培养箱中倒置培养，24～48 h后观察结果。

1.8 革兰氏染色镜检

用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量纯培养的细菌与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，自然干燥；待干燥后，在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1～3 min，水洗；后加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1 min，水洗；再加95%酒精脱色，作用15～30 s，水洗；最后加番红复染液复染1 min，水洗，自然干燥后镜检，观察细菌形态特征。

1.9 美兰染色

用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量纯培养的细菌与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，自然干燥；在已干燥固定好的玻片上，滴加适量的美兰染色液，经过1～2 min，水洗，干燥，镜检。

1.10 细菌纯化培养

挑取单个菌落在血液琼脂培养基上再进行分区划线，37 ℃培养24 h。连续纯培养3代，得到细菌的纯培养物，同时进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落于麦康凯琼脂平板和DHL琼脂平板上，放入37 ℃烘箱倒置培养24～48 h后观察结果，

1.11 生化试验

无菌操作，用接种环取纯培养的待检菌接种于各糖类微量发酵管中，倒置后于37 ℃温箱内培养24～48 h观察结果。若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化，发酵管中颜色发生改变；不分解此种糖类，则无颜色变化；产气可使倒置的小管内出现气泡。

1.12 药敏试验

挑取纯培养后的单个菌落，均匀涂布到血液琼脂平板的表面，然后将痢特灵、四环素等7种常用抗生素的药敏试纸分别贴到血液琼脂平板表面，先一块平板中央放药敏试纸一张，外周均匀分布6张，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈大小，根据标准进行判定。（高敏：抑菌圈直径大于15 mm；中敏：抑菌圈直径为10～15 mm；低敏：抑菌圈直径小于10 mm）

1.13 动物实验

用生理盐水稀释纯培养细菌，接种于2只SPF鸡，分别肌注0.2 ml，另取2只SPF鸡分别注射0.2 ml生理盐水作为对照，观察其症状。

2 结果

2.1 临床诊断

病鸭表现为不愿下水，精神差，缩头弯翅，口腔和鼻腔有粘液流出，呼吸困难，张口伸劲，摇头。食欲降低，饮欲增加，有部分鸭瘫痪，不能行走。病死鸭剖检可见肝脏肿大，密布较多白色坏死点（图1），心肌严重出血（图2），肺淤血，水肿。胆囊充盈、肿大。腹膜、皮下组织和腹部脂肪有出血点。肝脏触片美兰染色，镜检可见两极浓染的细小短杆菌。

图1 肝脏表面可见大量针尖大小坏死点

图2 心脏表面可见出血斑块

2.2 细菌分离

接种于血液琼脂培养基培养后可形成1 mm左右湿润水滴样，边缘整齐，表面光滑，淡灰白小菌落，不溶血；在麦康凯培养基、DHL琼脂培养基上不生长。分离纯化后的细菌经过革兰氏染色镜检后观察，视野中可见大量两极浓染的细小短杆菌（图3）。

图3 可见两极浓染的细小短杆菌（×1 000）

2.3 生化试验

本株细菌可以发酵葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、蔗糖，不发酵乳糖、水杨苷、尿素、鼠李唐，不能够液化明胶，产生硫化氢。生化试验结果符合多杀性巴氏杆菌生化特征。

2.4 药敏试验

药敏试验结果（表1）显示，分离到的巴氏杆菌对四环素、磺胺异恶唑、左氟沙星、痢特灵、庆大霉素、头孢他啶高度敏感，对壮观霉素中度敏感。

表1 药敏试验结果（mm）

2.5 动物实验

接种细菌的2只SPF鸡于18 h死亡，而注射生理盐水的2只SPF鸡未出现异常症状。解剖后发现胸部皮下、肌肉可见胶冻样渗出，腿肌出血，心冠脂肪有出血点，肝脏上可见针尖大小白色坏死点，胆囊未见明显的病理变化。肝脏触片美兰染色后镜检可见两极浓染的细小短杆菌。

3 小结与讨论

通过临床诊断，结合细菌的培养特性，生化试验，以及菌体特征的观察，表明所分离到的细菌为多杀性巴氏杆菌，诊断该鸭群暴发禽霍乱。与禽霍乱相关的多杀性巴氏杆菌的致病力或毒力比较复杂，而且常常发生变化，这主要取决于菌株差异、宿主本身的抵抗力及两者之间接触的条件。鸭对禽霍乱是高度易感的，该菌平时存在鸭体的消化道与呼吸道中，鸭体健康时，细菌与鸭体保持平衡状态，不引起发病，当机体的抵抗力下降或者环境因素改变时，这种平衡即被打破，疾病流行[7]。

通过药敏试验表明所分离的多杀性巴氏杆菌对四环素、磺胺异恶唑、左氟沙星、痢特灵、庆大霉素、头孢他啶均表现高度的敏感性，对壮观霉素表现出中度的敏感性。药敏试验中该菌株对左氟沙星是高度敏感，但是本病例用环丙沙星治疗效果较差，可能与药物用量、药物的含量与纯度不足有有关系。临床用药上，比较科学的用药方法是先对致病菌加以分离，通过药敏试验筛选最佳抗菌药物，最大程度的减少抗生素的滥用现象，防止耐药菌株的产生和扩散而造成更大的经济损失。但是，在实际的临床用药中，由于实际生产条件的局限性，或由于某些疾病发病呈现急性经过、急性死亡，从降低经济损失的角度出发，可根据流行病学、病理变化等做出的初步诊断，即给予药物治疗。依据本病例中疾病的流行特点、临床症状、病理变化做出初步判断为巴氏杆菌病，给以磺胺五甲氧嘧啶进行治疗，病情得到控制。

多杀性巴氏杆菌在多种家禽中易发，鸡、鸭和鹅易感，依据本病的流行特点，可采取如下防制措施：（1）加强饲养管理，改善家禽的养殖环境。（2）定期进行驱虫，给与合理的营养，防止营养缺乏。（3）依据天气情况，注意保温通风。（4）加强消毒，轮换使用消毒药，确保消毒效果。（5）夏季做好灭蚊驱虫工作，减少传播媒介。（6）加强免疫，由于多杀性巴氏杆菌具有多种荚膜血清型，选用疫苗时要加以注意。（7）将发病鸭和无症状鸭隔离饲养，保证充足的清洁饮水，添加维生素C、葡萄糖以保证能量需要及代谢平衡[8]。

[1]焦库华.禽病的临床诊断与防治[M].化学工业出版社，2003：193-196.

[2]王永坤，朱国强，金山，等.水禽病诊断与防治手册[M].上海科学技术出版社，2002：74-81.

[3]唐广文.禽病识别与防治手册[M].江西科学技术出版社，2000：123-126.

[4]陆承平.兽医微生物学[M].中国农业出版社，2001：248-252.

[5]崔忠道.鸡鸭鹅饲养与疾病防治新技术[M].中国农业出版社，1996：273-275.

[6]陈溥言.兽医传染病学[M].中国农业出版社，2006：131-134.

[7]刘丽颖，贺文琦，陆慧君，等.鹅巴氏杆菌病的病原分离鉴定及其病理学观察[J].动物医学进展，2007，28（10）：33-37.

[8]徐大节.雏鸭暴发巴氏杆菌病的诊断与防治措施[J].家禽科学，2007，（4）：30.