骨髓增生异常综合征患者白血病干细胞的表达

张 红 刘庆华 田 芳 周 丽

(泰山医学院附属医院,山东 泰安 271000)

MDS是一组异质性的克隆性髓系肿瘤,表现为外周血细胞一系或多系减少，髓系各阶段细胞形态发育异常，并且具有进展为急性白血病的高风险。许多研宄目前已经证实MDS是起源于造血干细胞的疾病。白介素-3受体a链(IL-3Ra)即细胞表面标志CD123被认为是白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC)的标志[1]，已有研究证实CD123在急性白血病患者中高表达,并且与不良预后相关[2]。而CD123在骨髓增生异常综合征(MDS)中的表达，国内外对此相关研究较少。我们通过流式细胞术检测MDS患者骨髓CD123的表达, 并进一步探讨其与MDS预后的相关性，为MDS的诊断及评价预后提供依据。

1 资料和方法

1.1临床资料

选择2010年11月至2012年8月在泰山医学院附属医院就诊的53例初治MDS患者,包括30例难治性贫血(RA)患者,23例难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)患者,其中男33例，女20例，中位年龄52岁(35～83岁)，所有患者均进行血清铁、铁蛋白、叶酸、维生素B12测定，直接、间接抗人球蛋白试验，糖水、酸溶血试验、T细胞亚群检测、抗核抗体、抗可提取性核抗原抗体(Anti extractable nuclear antigen antibody,ENA)谱的测定、骨髓细胞涂片、骨髓细胞免疫表型、骨髓染色体核型及骨髓病理等检查；30例非恶性血液病患者作为正常对照组，男19例，女11例，中位年龄42岁(21～69岁)，其中缺铁性贫血22例，免疫性血小板减少性紫癜6例，健康查体2例，诊断标准参照文献[3]。

1.2流式细胞仪测定白血病干细胞免疫表型

在无菌条件收集骨髓标本2～3ml，用EDTA抗凝。实验采用流式细胞仪三色(分别为FITC、PE、PerCP)标记法，以SSC/CD45设门检测免疫分型，具体步骤如下：

①流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测管中预先加单克隆抗体(CD34 CD38 CD123)，以及它们各自的同型对照单克隆抗体各20 μl。

②标记：加入适量的抗凝骨髓标本，充分混匀后室温避光孵育15 min。

③溶血：加入1×FACS溶血素2 ml，低速涡流混匀，室温避光静置8～10 min；如标本量较大、红细胞较多，需多加入1 ml溶血素。溶血后标本300 g离心5 min。

④洗涤：弃去上清，加入1 ml含有0.1% NaN3和1%～2% BSA的PBS洗液，300 g离心洗涤5 min。

⑤上机检测：弃去上清后加入PBS 200～500 μl，上机检测。

⑥以SSC/CD45设门检测其免疫分型,并且包括设门后检测CD34阳性细胞的百分比。

⑦选取CD34+细胞群的百分比，计算CD34+CD38-CD123+细胞占CD34+细胞的百分比。

1.3IPSS预后积分及危险度分组

依据骨髓原始细胞百分比、骨髓造血细胞染色体核型以及外周血细胞减少系列数进行国际预后积分系统(International Prognostic Scoring System,IPSS)积分,将53例MDS患者分为低危组、中危-I组、中危-II组和高危组。危险度分组标准:低危：0分,中危-Ⅰ 0.5～1分,中危-Ⅱ1.5～2.0分,高危≥2.5分[4]。

1.4 统计学分析

结果采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量数据采用均值 ±标准差的形式表示，均数比较采用t检验，多组比较采用方差分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1白血病干细胞免疫表型CD34+CD38-CD123+的测定

测得MDS组骨髓单个核细胞中CD34+/有核细胞为5.49±5.64%，正常对照组为0.28±0.36%，MDS组明显高于正常对照组(P<0.01)，并且测得MDS组及对照组CD34+CD38-CD123+/CD34+细胞的比例分别为14.29±7.89%、1.22±0.89%，两组差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 MDS患者骨髓单个核细胞CD34+细胞以及CD34+CD38-CD123+细胞比例的比较(%)

注：a:t=5.042,P=0.000; b:t=9.013,P=0.000

2.2CD34+CD38-CD123+/CD34+与IPSS积分的分析

低危组3例，中危-I组29例,中危-II组16例、高危组5例,均表达CD123，进行方差分析显示，差异有统计学意义，F=5.604,P=0.002 ，用LSD方法做组间两两比较，高危组与中危-I组,中危-II组与中危-I组，中危-I组与低危组间的表达差异均有统计学意义(P<0.05);但是CD123在中危-II组与高危组间表达的差异尚不明显(P>0.05)(表2)。

表2 CD34+CD38-CD123+细胞比例(%)在MDS不同预后中的比较

分组例数CD34+CD38-CD123+/CD34+(%)低危组34.13±2.65 中危-I组2910.87±3.40a中危-II组1616.97±5.81b高危组519.91±6.73c

a与低危组相比P=0.038；b与中危-I组相比P=0.015；c与中危-II相比P=0.585

3 讨 论

近年来，人们研究发现LSC具有自我更新、多向分化、对凋亡刺激耐受以及处在静止期等特性，成为影响白血病发生、发展、耐药、复发及预后的影响因素之一[5-7]。对LSC的研究， 发现LSCs 所表达的免疫表型为CD34+CD38-。进一步研究发现，在白血病患者的CD34+CD38-细胞中高表达CD123+,但是在正常人的CD34+CD38-的细胞中几乎检测不到CD123+，因此免疫表型为CD123+的细胞被认为是白血病干细胞特有的标志[1]。骨髓增生异常综合征是一种干细胞水平的恶性血液疾病, 关于其发病机制，近年来国内外学者通过研究得到的线索有所增加，如利用PCR，分析MDS患者的蛋白质表达谱[9]；从遗传学角度，分析DNA甲基化对细胞周期失控的影响[10];通过流式细胞仪检测异常免疫表型等,但是其确切机制仍未明了，目前临床诊断仍旧主要依靠细胞形态学，缺乏客观诊断指标[8]。鉴于MDS高风险转化成急性髓系白血病的疾病特点,那么,我们考虑MDS患者体内是否也存在LSC?

在本实验中，我们应用流式细胞仪对MDS患者骨髓的单个核细胞进行白血病干细胞免疫表型测定，发现在MDS组，CD34+细胞比例增高，进一步检测发现该组患者CD34+CD38-CD123+细胞的比例显著高于正常对照组，这与李丽娟等[11]的研究结果相一致。证实了MDS患者体内存在类似于LSC的细胞，这类细胞可能是MDS的恶性根源，与MDS处于白血病前期并且具有高风险转化为急性白血病的本质有关。

MDS国际预后积分系统(International Prognostic Scoring System,IPSS)将MDS分为低危、中危I、中危II和高危四个危险度，对提示患者的生存期及白血病转变具有肯定意义。本实验通过数据分析发现随着IPSS预后积分的递增，CD34+CD38-CD123+/CD34+的比例在低危组、中危组、高危组的表达逐渐升高，因此，我们认为了解MDS患者的CD123的异常表达有助于疾病判断预后。由于本组病例数较少,未能区分出CD123在IPSS中危II组与高危组之间表达上的差异,考虑主要是由于病例数的有限性，进一步扩大病例数的临床研究可能会得到更准确的结果。

总之，本实验发现在MDS患者的骨髓中LSC的标志CD123呈高表达，而且随着IPSS预后积分的递增，CD123的表达逐渐升高，因此，对该团细胞的检测有助于早期识别MDS恶性克隆，对其诊断和评价预后具有一定的意义。

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