金银花总黄酮对小鼠应激性肝损伤的保护作用*

杨 凯 蔡 芳 柳 源 苏设镇 徐晓燕

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016)

金银花(Lonicerae Japonicaer Flos)为忍冬的干燥花蕾或初开的花[1]，含有机酸、黄酮类、三萜类和挥发油等化学成分，是中医临床常用的中药之一[2-4]。现代药理研究证实金银花中三萜类成分具有保肝利胆的作用，而金银花总黄酮(TFL)相关生物学活性研究较少。国内外研究提示，黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂, 具有清除人体中超氧离子自由基的生理活性，因此对金银花总黄酮(TFL)进行研究具有重要意义。

Kurihara[5]等的研究证明小鼠在应激负荷状态下体内产生活性氧自由基大量生成而使自由基的生成和消除失去平衡,过多的活性氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而发生脂质过氧化反应,损伤肝脏中的各种细胞, 本试验以拘束负荷诱发小鼠应激性肝损伤为模型，以血清AST、ALT活力；肝组织的SOD活力、MDA含量及肝脏形态学的改变为指标，观察金银花总黄酮对小鼠应激性肝损伤的保护作用，并初步探讨其作用机理。

1 材料与方法

1.1动物 昆明种小鼠，体重18～22 g，由泰山医学院实验动物中心提供。

1.2药品与试剂 金银花中药饮片(购自泰安金泰联医药商行)，维生素C(泰山医学院药剂实验室提供)，芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)，谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒(以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：20110411)。

1.3仪器与设备 SHB-95A型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；S-54紫外分光光度仪，上海校光技术有限公司；Bio-rad680酶标仪。

1.4方 法

1.4.1金银花总黄酮的提取、纯化及含量测定 中药饮片金银花使用70%乙醇回流提取3次，得金银花总黄酮粗品。粗品选用AB-8大孔吸附树脂70%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥得金银花总黄酮。以芦丁为标准品，测得所提取样品中金银花总黄酮的含量为71.28% 。

1.4.2动物分组及给药 实验将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、金银花总黄酮低、中、高剂量组。金银花总黄酮低、中、高剂量组分别给予金银花总黄酮100 mg.kg-1.d-1、200 mg.kg-1.d-1、400 mg.kg-1.d-1；正常组及模型组给予等容量蒸馏水，连续1周。末次给药30 min 后模型组和各给药组给予一次性拘束18 h(15∶00～9∶00)，小鼠拘束装置参照文献利用50 ml尖底塑料离心管改制，拘束期间小鼠禁食禁水，正常组不拘束只禁食禁水。

1.4.3指标观察和方法 造模18 h后，摘眼球取血约1 ml，静置30 min，3000 r/min离心10 min后，取上清液以检测血清AST和ALT的活性；取血后立即在冰盘上颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔，暴露肝脏，取肝左叶相同部位的一小块肝组织固定于4%甲醛溶液中，常规脱水，石蜡包埋，切片，作HE染色，观察肝组织的病理改变。剩余肝组织加预冷生理盐水制成10%的匀浆，待测肝SOD活性和MDA的含量。

2 结 果

2.1小鼠血清AST和ALT活力的测定 金银花总黄酮对拘束应激负荷小鼠血清ALT、AST活力的影响见表1。与正常组相比，模型组小鼠血清中的AST，ALT的活力均显著升高(P﹤0.01)，表明拘束应激诱发的肝损伤模型成功。与模型组相比，TFL各剂量组和VitC组均有降低小鼠血清过高的AST、ALT水平，而TFL高剂量组作用尤为突出，但低、中剂量组作用没有明显差别。

表1 金银花总黄酮对拘束应激负荷小鼠血清ALT、AST活力的影响

注：与正常组相比▲▲P﹤0.01；与模型组相比★P﹤0.05，★★P﹤0.01

2.2小鼠肝脏组织匀浆中的SOD、MDA的影响 金银花总黄酮对拘束应激负荷小鼠肝脏中SOD、MDA活力的影响见表2。与正常组相比, 模型组小鼠肝匀浆MDA水平显著升高, 同时SOD水平显著降低(P<0.01)；与模型组相比，TFL各剂量组和VitC组均有降低应激性肝损伤小鼠升高的肝匀浆MDA水平，且随TFL浓度升高，降低作用愈加显著；同时，TFL各剂量组和VitC组亦均升高了其低下的SOD水平，且高剂量组作用最为显著(P<0.01)。

表2 金银花总黄酮对拘束应激负荷小鼠肝脏中SOD、MDA的影响

注：与正常组相比▲▲P﹤0.01；与模型组相比★P﹤0.05，★★P﹤0.01

2.3肝脏形态学及病理切片观察 正常组小鼠肝脏肉眼观呈鲜红色，有光泽，质地软而富有弹性，模型组小鼠肝脏体积较正常对照组稍增大，质地稍韧而脆。HE染色光镜下观察，模型组小鼠肝细胞排列紊乱，细胞浆内含有少量大小不一的脂肪空泡，中央静脉周围可见大量炎细胞浸润；正常组小鼠肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐围绕中央静脉呈放射状，肝窦清晰可见，汇管区未见炎细胞浸润；金银花总黄酮组小鼠肝脏仍可见索条状排列的肝细胞，仅见少量炎细胞浸润，细胞损伤及炎性改变均有所减轻。见图1。

空白组 (HE, 400×)

模型组 (HE, 400×)

金银花总黄酮低剂量组 (HE, 400×)

金银花总黄酮中剂量组 (HE, 400×)

金银花总黄酮高剂量组 (HE, 400×)

3 讨 论

本实验中，小鼠拘束负荷18h后，ALT、AST水平升高的同时，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量亦明显增加，表明拘束负荷引起的肝损伤病理过程可能与机体氧化应激状态有关系，肝脏在应激负荷状态下活性氧自由基的生成和消除失去平衡，过剩产生的活性氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸继而发生脂质过氧化反应，破坏脂肪酸链和细胞膜的完整性，损伤肝细胞，表现为血清ALT、AST活性的增高和MDA含量增加，此结论与Rauen等[6]的研究结果相一致。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，是体内清除自由基的首要物质，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。肝损伤时由于肝脏组织抗氧化能力降低，自由基积累，攻击生物膜中多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，产生高水平脂质过氧化物(MDA)，参与病理改变。因此肝组织中SOD的活性和MDA的含量可间接反映肝细胞膜脂质过氧化的强弱和肝细胞损伤的程度。由实验结果可以看出，模型组小鼠血清中的ALT、AST活性以及MDA含量明显升高，SOD水平显著降低；而金银花总黄酮组和维生素C对照组的小鼠血清中的ALT、AST活性以及肝脏组织MDA含量与模型组相比显著降低，SOD活力显著升高。有文献证明，维生素C是一种强力自由基清除剂，具有清除氧自由基和抑制脂质过氧化的能力，可用于与过氧化有关的肝损伤疾病的治疗[7]；而宫璀璀[8]等研究指出，金银花总黄酮可以提高机体的抗氧化能力。在本实验中, 金银花总黄酮明显地改善因拘束负荷增高的肝脏组织匀浆MDA含量和ALT活性,表现出与维生素C相类似的抗氧化效果，说明金银花总黄酮可能通过提高自身抗氧化能力、缓解脂质过氧化状态，有效的防止应激状态下活性氧引起的过氧化损伤，从而改善了小鼠应激性肝损伤的发生。

[1] HUANG L Y, LU Z Z. Studies on the chemical constituents of Japanese Honeysuckle ( Con icera Japonica) [J] .Ch in Trade it Herb Drugs(中草药) , 1996, 27( 11) : 645-647.

[2] 高玉敏. 金银花化学成分的研究[J].中草药,1995,26(1):568-569.

[3] Lan W, Zhao jun Z, Zesheng Z. Characterization of antioxidant activity of ex tracts from Flos Lonicerae[J] .Dr-ug Dev I and Pharm , 2007, 33( 8) : 841.

[4] 黄雄, 李松林, 李萍,等. HPLC法同时测定金银花中8种黄酮的含量[J].药学学报, 2005,40(3):285.

[5] Kurihara H, Koda H，A sami S, et al. Contribution of the antioxidative property of a staxanthin to its protective effect on the promotion of cancer metastasis in mice treated with restraint stress [J].Life Sci , 2002, 70(21): 2509-2520 .

[6] Rauen U, Reuters I, FuchsA, et al. Oxygen-free radical-mediated injury to cultured rat hepatocytes during cold incubation in preservation solutions[J]. Hepatology , 1997,26(2):351-357.

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[8] 宫璀璀，郑玉霞，郑乃刚,等.金银花在体内抗氧化作用的实验研究[J].实用医药杂志,2006,23(5):584-585.