产酸丙酸杆菌生长特性及5 L罐发酵动力学研究＊

梁泽鑫，王菊芳

(1.广东省医疗器械质量监督检验所，广东 广州 510080;2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

丙酸作为一种精细化工产品和有机合成材料，被广泛用作食品、谷物、饲料的防腐剂［1-2］，相比于苯甲酸，山梨酸，因为其安全性、经济性受到了人们的普遍欢迎，并且丙酸及其盐被美国食品药品监督管理局认定为GRAS(Generally recognized as safe即一般认为安全)［3］;其衍生物在制药、塑料、香料、除草剂等行业中也有广泛的应用［1-3］。

美国和德国是丙酸生产大国，其产量约占全球丙酸总产量的90%以上，这些基本上采用化学合成的方法来生产，2006年全球丙酸需求量为349000吨，2006-2010这五年间，丙酸全球年消费增长率大约为2.5%［4］;在我国，丙酸年产量仅为1000多吨，远远不能满足市场需求，随着我国经济腾飞，饲料，食品，医药，农药等行业也飞速发展，对丙酸的需求量越来越大，据相关文献报道，我国丙酸进口量从1996年6700吨增加到 2004年的1.6万吨［5］。

目前丙酸的生产主要采用化工合成的方法，但随着石油资源的日益匮乏及人们对环境保护的重视，微生物发酵法生产丙酸作为一种替代途径越来越受人们的青睐［6］。相比石油化工法，微生物发酵法生产丙酸具有以下优势，首先，化学合成法生产丙酸的所需原料丙烷，丙醛等的价格易受当今石油产量和价格的波动而波动，原料供应不畅容易造成丙酸市场的不稳定;其次，通过发酵法制得的丙酸用作食品防腐剂，其安全性更易被人们接受认可;第三，现在丙酸菌已经被人们广泛应用于乳酪工业，不存在安全性隐患;第四，相比石油化工的高污染、高能耗，发酵法生产丙酸过程温和，环境友好性强，符合当今可持续发展和低碳工艺的理念。

产酸丙酸杆菌被认为是微生物发酵生产丙酸的最理想菌株［7］，本实验室保存有美国俄亥俄州立大学杨尚天教授赠送的一株产酸丙酸杆菌，本文从该菌的基本生长特性、底物利用情况、产物抑制等方面出发，研究该菌发酵产丙酸的情况，并对其生长条件进行优化，最后在5L发酵罐水平研究该菌发酵葡萄糖生产丙酸的动力学，初步了解该菌发酵产丙酸的能力。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

菌种Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875为美国俄亥俄州立大学杨尚天实验室馈赠培养基成分:葡萄糖5-60 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2PO40.25 g/L，MnSO40.05 g/L。

1.2 仪器与设备

赛多利斯科学仪器公司生产的PB-10酸度计，Thermo Fisher Scientific公司生产的Genesys 10 vis分光光度计，广州柯桥有限公司生产的恒温振荡器，上海海太光电生物科技有限公司生产的厌氧罐和自动厌氧抽排系统，德国贝朗公司生产的5LBraun型发酵罐，Waters公司生产的Waters2695高效液相色谱仪，Milford公司生产的RI-2414视差折光检测器，美国Bio-Rad公司生产的Aminex HPX-87H型有机酸柱。

1.3 菌体生长特性研究

在摇瓶水平对该菌的生长特性进行研究，所用摇瓶规格为100 mL血清瓶，以胶塞密封，充高纯氮气保证产酸丙酸杆菌生长所需的厌氧环境。研究内容包括菌体生长曲线及初始pH、温度、摇床转速、接种量、种龄对产酸丙酸杆菌生长和产酸的影响，探讨该菌可以利用的碳源谱、氮源谱范围，不同初始葡萄糖浓度对产酸丙酸杆菌生长和产酸的影响，为了解丙酸盐对菌体的产物抑制情况，对不同初始浓度的丙酸盐(丙酸钠和丙酸钙)进行了研究。

1.4 5 L罐发酵动力学研究

以1.3中确定的丙酸菌最适生长条件，往5 L发酵罐中通入高纯氮气保证发酵过程中的厌氧环境，研究产酸丙酸杆菌利用葡萄糖发酵生产丙酸的动力学。

1.5 测定方法

1.5.1 生长量测定 取不同时间的发酵液，用Genesys 10 Vis分光光度计在600 nm处测定吸光值。通过吸光值与对应细胞干重的校正曲线得出，1个吸光度值对应约0.362 g/L的细胞干重。

1.5.2 残糖及发酵产物的检测 使用Waters2695液相色谱仪，检测器为Milford RI-2414型视差折光检测器，色谱柱为Aminex HPX-87H柱，柱温为60℃，以25 mmol/L的H2SO4为流动相，流速为0.6 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 生长曲线的测定

以5%的接种量接种至50 mL培养基中，混匀后使用无菌注射器抽取8 mL于15 mL西林瓶中，放置于32℃、150 r/min摇床中培养72 h，每隔4 h测定一次菌液OD600，得到 P.acidipropionici的生长曲线测定结果，如图1所示，从图中的生长曲线可以看出，延迟期大约为10 h，50 h后即进入稳定生长期，菌体生长最大OD600为7.5左右。

图1 产酸丙酸杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of P.acidipropionici

2.2 温度、初始pH、摇床转速、种龄及接种量对产酸丙酸杆菌菌生长和产酸的影响

在5 g/L葡萄糖浓度的培养基中，研究温度、pH、摇床转速、种龄、接种量对产酸丙酸杆菌的影响，结果如下图2所示:

温度和初始pH作为发酵的重要影响因素［8-9］，菌体及体内各种酶均随温度和pH的变化而受到影响。由图2(A)和(B)可知，产酸丙酸杆菌生长及产酸最适温度为32℃，最适pH为7.0，此时菌体干重及丙酸产量均达到最大值，菌体干重分别为2.10 g/L和2.28 g/L，丙酸浓度分别为2.10 g/L 和 2.71 g/L。因种子液中产物有酸，pH呈酸性，接种后会造成培养基初始pH的下降，故在发酵罐水平控制pH在6.5左右。由图2(C)知，摇床转速控制在150 r/min时，产酸丙酸杆菌菌体及产酸均达到最大值，分别为1.84 g/L 和1.97 g/L。由图2(D)看出，接种24 h种龄丙酸菌，发酵液中菌体及丙酸产量达最大值，分别为 1.98 g/L 和 1.95 g/L。由图 2(E)得出，1%、3%的接种量下，菌体生长延迟期较长，在8%、10%的高接种量下，菌体达到稳定期后，容易衰亡，因此确定5%是最佳接种量值，此时，菌体及丙酸产量分别为1.82 g/L 和 1.98 g/L(图2 F 所示)。

2.3 碳源、氮源发酵实验

不同微生物菌种具有不同的碳源谱和氮源谱，在5 g/L碳源浓度下，培养36 h，测得菌体产量，结果如图3(A)所示;在 1.4 g/L氮元素浓度下，培养36 h，测得菌体产量，结果如图3(B)所示:

由图3(A)得出，产酸丙酸杆菌能够利用的底物范围很广，多数单糖(戊碳糖和六碳糖)和双糖均可被产酸丙酸杆菌利用，需要指出的是，乳酸盐和甘油作为两种特殊的碳源，也可以被该菌利用。近年来，生物柴油作为一项研究热点，在其生产过程中，会产生大量的甘油副产物［10-11］，这一廉价的副产物原料对于产酸丙酸杆菌而言是一很有前景的廉价碳源。由图3(B)得出，该菌不能利用无机氮源，而酵母抽提物和胰蛋白胨两种氮源混合使用，对该菌生长具有促进作用，与单独以等量的酵母抽提物或胰蛋白胨为氮源，菌体产量要高出30.49%和282.14%(2.15 g/L vs.1.64 g/L 和 0.56 g/L)。

2.4 不同初始葡萄糖浓度对产酸丙酸杆菌生长及产酸的影响

通常高底物浓度会对菌体生长产生抑制现象，在不同初始葡萄糖浓度培养基中，考察其对产酸丙酸杆菌生长及产酸的影响，结果如图4、5所示:

由图4得出，当葡萄糖浓度由10 g/L到50 g/L范围内，丙酸菌生长曲线没有很大变化，没有显现出明显的底物抑制现象，相反在低葡萄糖浓度下(5 g/L)，丙酸菌菌体产量较低，且在发酵末期，因为碳源耗尽而出现菌体衰亡的现象。在100 g/L下，菌体生长延迟期较长，且菌体产量较低。此现象与所采用的实验方法有关，因为是在密封的血清瓶中培养，培养基经高压灭菌后，经检测100 g/L葡萄糖所对应的培养基的理化性质发生了很大改变，培养基颜色加深，pH由7.0左右降低到5.45左右，由5.2中结论可知，pH是造成丙酸菌生长缓慢的重要原因，因而还不能得出，高浓度的葡萄糖浓度(100 g/L)对丙酸菌生长具有底物抑制现象。

由图5可知，在摇瓶培养阶段，因为丙酸的强产物抑制现象，丙酸浓度达4.5 g/L左右，即不再消耗底物。在5 g/L葡萄糖浓度下，经过36 h发酵，葡萄糖被耗尽，丙酸终浓度达2.1 g/L。在10 g/L葡萄糖浓度下，因为丙酸的强底物抑制，经过80 h发酵后，残糖浓度为 1.8 g/L，发酵液中丙酸达 4.2 g/L，此时，细胞干重维持在一稳定值3.7 g/L，丙酸浓度也不再上升。

2.5 不同初始丙酸盐浓度对产酸丙酸杆菌生长的影响

以10 g/L葡萄糖为碳源，考察不同丙酸盐浓度对产酸丙酸杆菌生长的影响，结果如下图所示:

图2 温度，初始pH，摇床转速，种龄，接种量对产酸丙酸杆菌的影响Fig.2 The compare of temperature，initial pH，speed of incubator，age of seed culture，initial cell concentration for P.acidipropionici;(A)Temperature;(B)Initial pH;(C)Speed of incubator;(D)Age of seed culture;(E)(F)Initial cell concentration

图3 不同碳源和氮源对产酸丙酸杆菌生长的影响Fig.3 Influence of different carbon and nitrogen sources on the growth of P.acidipropionici

图4 不同浓度葡萄糖对丙酸生长的影响Fig.4 Growth curve of P.acidipropionici effected by different glucose concentration

图5 不同浓度葡萄糖对丙酸发酵的影响Fig.5 Propionic acid fermentation effected by different glucose concentration

由图6可知，随丙酸盐浓度的增加，产酸丙酸杆菌菌体产量逐渐下降。初始丙酸盐浓度在2 g/L时，菌体生长即受抑制，与对照相比菌体产量减少62.43%(2.988 g/L vs.7.953 g/L);当初始丙酸盐浓度为20 g/L时，丙酸菌基本不生长。国外已经有很多文献报道过关于丙酸的强产物抑制现象，并指出丙酸的强产物抑制是造成微生物发酵法生产丙酸浓度低，产物转化率低和产率低的重要原因［12］。

2.6 5 L发酵罐发酵生产丙酸动力学

在摇瓶培养阶段，随着菌体生长，发酵液pH逐渐降低，在pH值小于4.5时，产酸丙酸杆菌生长极其缓慢，产物生成也相应终止，为探讨在调控pH的条件下，产酸丙酸杆菌生长量及产酸水平，按照摇瓶培养阶段确定的最佳发酵条件，温度32℃，pH 6.5，取培养24 h的种子液，以5%的接种量接种，在5 L罐水平上考察产酸丙酸杆菌生产丙酸的发酵动力学，结果如图7所示:

图6 不同浓度丙酸盐对丙酸菌生长的影响Fig.6 Cell biomass of Propionibacterium acidipropionici effected by different propionate concentrations

图7 游离产酸丙酸杆菌生产丙酸的发酵动力学曲线 Fig.7 Kinetics of propionic acid production by free P.acidipropionici cells at pH 6.5 and 32 ℃

如图7所示，经过76 h的发酵，葡萄糖(初始浓度58.8 g/L)即被消耗完全。丙酸终浓度达22.4 g/L，丙酸得率和产率分别为0.381 g/g和0.295 g/L/h，同时有4.23 g/L的乙酸和4.44 g/L的琥珀酸产生，菌体产量达8.81 g/L，丙酸占总酸含量的72.10%。

国内仪宏等人［13］，利用薛氏丙酸杆菌发酵生产丙酸，批次发酵得丙酸终浓20.9 g/L，丙酸得率为0.40 g/g;冯小海等人［14］，利用费氏丙酸杆菌，初始葡萄糖浓度为40 g/L，游离细胞发酵120 h后，丙酸终浓度达 12.58 g/L，丙酸产率仅为 0.12 g/L/h，采用FBB固定化发酵生产丙酸，经补料发酵280 h，丙酸产量达45.91 g/L，为国内有关丙酸产量报道的最高值。

3 结论和展望

(1)通过对产酸丙酸杆菌基本生长特性的研究，确定其最适生长温度为32℃，最适初始pH值为6.5，最佳摇床转速为150 r/min，最佳接种菌龄为24 h，最佳接种量为5%;

(2)通过对不同初始葡萄糖浓度的研究，得出在产酸丙酸杆菌生长过程中，无明显底物抑制现象;

(3)产酸丙酸杆菌可利用碳源种类十分丰富，一般的单糖、双糖均可利用，能够以乳酸盐和甘油为碳源，但不能利用淀粉等多糖，酵母抽提物和胰蛋白胨对该菌生长具有协同促进作用;

(3)丙酸盐浓度高于2 g/L时，产酸丙酸杆菌生长受明显抑制;

(4)在5 L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为58.8 g/L，经72 h发酵，丙酸、乙酸、琥珀酸终浓度分别达22.4 g/L、4.23 g/L、4.44 g/L，丙酸得率和产率分别为 0.381 g/g和 0.295 g/L/h。

(5)与国内同行相比，在游离细胞发酵中，产酸丙酸杆菌发酵生产丙酸具有一定优势，为提高丙酸发酵水平，可考虑采用固定化细胞发酵工艺来实现。

致谢!

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