星点设计-效应面法优化藤黄酸纳米混悬剂处方

张文君，吴 凡，王 鑫，谭亚楠，李 艺，陈立江

（辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036）

星点设计-效应面法优化藤黄酸纳米混悬剂处方

张文君，吴 凡，王 鑫，谭亚楠，李 艺，陈立江*

（辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036）

目的制备藤黄酸纳米混悬剂，并对处方及制备工艺进行优化。方法 采用高压均质法制备藤黄酸纳米混悬剂，以粒径、多分散系数、zeta电位为评价指标，采用星点设计-效应面法优化藤黄酸纳米混悬剂的处方，并对处方进行验证。同时对制得的藤黄酸纳米混悬剂进行表征。结果 对实验结果进行模型拟合，用效应面法预测最佳处方。最优处方下制备得到的藤黄酸纳米混悬液粒径为258.7 nm，多分散系数为0.186，平均zeta电位为-28.9 mV。结论 星点设计-效应面法适用于藤黄酸纳米混悬剂的处方优化，且优化所得处方具有良好的预测性。

药剂学；星点设计；藤黄酸；纳米混悬剂；高压均质

藤黄是藤黄科植物藤黄( Garcinia hanburyi Hook．f．) 树干经切伤后所分泌的干燥树脂。而藤黄酸（gambogic acid, GA）为藤黄的主要有效成分，具有显著的抗肿瘤活性[1-4]，但水溶性差限制了其应用。纳米混悬剂(nanosuspensions, NS)是纯药物纳米颗粒的亚微细粒胶态分散体，以微量的表面活性剂为助悬剂，通过匀化、湿磨等方法制备[5-6]，主要应用于溶解度差的药物[7-8]。本研究作者采用高压均质法将藤黄酸制成纳米混悬剂，并采用星点设计-效应面法对处方进行优化，以期得到处方简单、工艺稳定、重现性及预测性良好的藤黄酸纳米混悬剂。

1 仪器与材料

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义英峪予华仪器厂），KQ5200DB数控超声波清洗器、Nano-ZS纳米粒度及zeta电位分析仪(英国Malvern仪器公司)，RE5299旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），110L高压均质机（美国Mfic公司）。

藤黄酸（实验室自制），pluronic F68（美国Sigma公司），卵磷脂（供注射用，PC ≥90%，上海太伟药业有限公司，批号20110704），无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 制备方法

称取藤黄酸溶于无水乙醇中，在低温（0～3 ℃）搅拌下（3 000 r·min-1）缓慢注入含pluronic F68、卵磷脂的水溶液中，使其分散均匀，滴加完毕，旋除乙醇，得粗混悬剂。将所得粗混悬剂于3.21×103Pa压力下均质2次，8.03×107Pa压力下均质12次，即得藤黄酸纳米混悬液。

2.2 单因素考察

2.2.1 均质压力对粒径的影响

按“2.1”条方法制备藤黄酸粗混悬剂，所得粗混悬剂于3.21×103Pa均质2次，分别于4.82×107Pa、6.43×107Pa、8.03×107Pa、9.64×107Pa、1.12×108Pa、1.29×108Pa压力下均质12次，采用激光粒度分布仪对所得纳米晶的粒径进行考察。结果表明，当均质压力为8.03×107Pa时，所制备的藤黄酸纳米混悬剂具有最小粒径。结果见图1。

图 1 高压均质压力对粒径的影响（n=3）Fig. 1 The effect of homogenization pressure on particle size (n=3)

2.2.2 均质次数对粒径的影响

按“2.1”条方法制备藤黄酸粗混悬剂，所得粗混悬剂于8.03×107Pa压力下分别均质2、4、8、12、18和24次取样，采用激光粒度分布仪对所得纳米晶的粒径进行考察。结果表明，当均质次数为12次时，所制备的藤黄酸纳米混悬剂具有最小粒径。结果见图2。

图 2 高压均质次数对粒径的影响 (n=3)Fig. 2 The effect of high pressure homogenization on particle size (n=3)

2.2.3 无水乙醇用量的考察

称取藤黄酸分别溶于1、5和10 mL无水乙醇中，按“2.1”条方法制备藤黄酸纳米混悬剂。采用激光粒度分布仪对所得纳米晶的粒径进行考察。结果见表1。

表 1 藤黄酸在无水乙醇中的浓度对纳米混悬液粒径的影响（n=3）Table 1 The effect of concentration of GA in absolute ethyl alcohol on particle size(n=3)

结果显示，无水乙醇用量对纳米混悬液的粒径有一定影响，且随无水乙醇用量的增加，纳米混悬液的粒径减小。因有机溶剂具有一定毒性，最终选择加入无水乙醇1 mL。

2.3 星点设计-效应面法优化处方

2.3.1 星点设计

通过预实验，确定影响藤黄酸纳米混悬剂处方的主要因素，并在此基础上，利用星点设计-效应面法对3个显著的影响因素做进一步的优化。以卵磷脂（X1）、伯洛沙姆（X2）及藤黄酸（X3）的质量作为考察因素，以粒径、多分散系数、zeta电位为评价指标，采用三因素、五水平的星点设计-效应面法对藤黄酸纳米混悬剂的处方进行优化，因素水平设计表见表2，试验结果见表3。

表 2 因素水平设计表Table 2 Variables and levels in the central composite experimental design

表 3 星点设计试验结果Table 3 Results of central composite design experiments

Continued table 3

根据试验结果，以三因素（X1、X2、X3）作为自变量，粒径、多分散系数、zeta电位为评价指标，采用Design Expert 8.0.6软件，分别对各因素进行多元线性及二项式拟合，结果显示，二项式方程拟合较好且其置信度明显优于多元线性方程。所得二项式方程如下：

2.3.2 效应面优化

各效应值的效应面曲线显示了分别对各指标的影响，结果见图3～5。

由图3～5可见，在一定范围内Y1、Y3随X1、X2的增大呈上升趋势，随X3的增大而呈下降趋势；Y2随X1、X2、X3的增大呈上升趋势。Y1与制剂体系的分布均匀程度有关，因此，在一定范围内，Y1越小说明其分散性越好；Y2及Y3分别体现了制剂中粒径的分布情况和制剂的稳定性，Y3的绝对值越大，表明该体系具有较好的稳定性，Y2在一定范围内优先选择粒径较小的制剂处方，经过Design Expert 8.0.6对处方进行优化，得到最佳处方。即藤黄酸纳米混悬液中，波洛沙姆质量浓度为0.6 g·L-1，卵磷脂质量浓度为0.63 g·L-1，藤黄酸质量浓度为0.75 g·L-1。

图 3 多分散系数与X1、X2、X3效应面三维图和二维等高图Fig. 3 Effect of X1、X2、X3 values on PDI with 3D surface plot and 2D contour plot

图 4 粒径与X1、X2、X3效应面三维图和二维等高图Fig. 4 Effect of X1、X2、X3 values on size with 3D surface plot and 2D contour plot

图 5 Z eta与X1、X2、X3效应面三维图和二维等高图Fig. 5 Effect of X1、X2、X3 values on zeta with 3D surface plot and 2D contour plot

2.4 最优处方验证

按照以上优化所得处方工艺，制备3批藤黄酸纳米混悬液，并对实际的多分散系数、粒径及zeta电位进行测定，结果见表4。

表 4 星点设计-效应面优化法的验证(n=3，?±s )Table 4 Verification of the central composite design and response surface method(n=3，?±s )

由表4可见，各指标的预测值与实测值的偏差均较小，说明采用星点设计-效应面法所得到的数学模型可以较好地描述各因素与指标间的关系，预测性好，适用于藤黄酸纳米混悬剂的处方优化。

2.5 藤黄酸纳米混悬剂的表征

取适量藤黄酸纳米混悬液，将其稀释至适当浓度，滴1滴于密封膜上，将铜网带有碳膜的一面接触样品液体后，用镊子小心地将铜网夹起，用小滤纸片吸去铜网边缘处多余的溶液，用镊子轻轻取下，拭去边缘处多余溶液，在白炽灯下烤干后在透射电镜下观察。图6为藤黄酸纳米冻干粉在透射电镜下观察到的微观形态，药物在混悬剂中呈现球形粒子分布，且粒径较为均一。

图 6 藤黄酸纳米混悬剂扫描电镜图Fig. 6 Transmission electron microscop image of gambogic acid nanosuspensions

3 结论

通过试验，采用星点设计的方法，优选出藤黄酸纳米混悬剂的最佳处方。以卵磷脂及波洛沙姆为稳定剂，采用高压均质法制备藤黄酸纳米混悬剂，粒径为258.7 nm，多分散系数为0.186，平均zeta电位为-28.9 mV。

4 讨论

目前，药剂处方优化时多采用正交设计及均匀设计，两者皆为基于线性模型的设计。而大多数情况下，各因素间存在交互作用而对效应的影响并非线性。因此，线性模型具有精度不够、预测性较差等缺陷[9]。效应面优化法为一循序渐进的方法，根据单因素实验的结果，确定因素水平的极大值和极小值，再根据效应面设计的方法确定其他几个水平，更具科学性。因其实验次数少、并可进行线性或非线性拟合的实验设计方法，已在制剂工艺及处方筛选优化中得到了一定范围的应用[10]。

本试验采用星点设计-效应面法优化藤黄酸纳米混悬剂的处方，建立了二项式模型并绘制效应面图，通化效应面曲线的优化及软件处理，得到最优处方，所制备的纳米混悬剂粒径与预测值接近，藤黄酸纳米混悬剂分散均匀度好，为其进一步研究奠定了实验基础。

[1] LIU Wei, GUO Qing-long, YOU Qi-dong, et al. Anticancer effect and apoptosis induction of gambogic acid in human gastric cancer line BGC-823 [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(24): 3655-3659.

[2] GUO Qing-long, YOU Qi-dong, WU Zhao-qiu, et al. General gambogic acids inhibited growth of human hepatoma SMMC-7721 cells in vitro and in nude mice [J]. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(6): 769-774.

[3] 张洪明, 朱晓莉, 陈保安, 等. 藤黄酸诱导SPC-A-1 肺腺癌细胞凋亡机制的探讨 [J]. 实用临床医药杂志, 2009, 13(2): 44-47.

[4] 晏烽根, 李庆林. 新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡以及对p-p38 和p-ERK1/2 蛋白的影响[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(3): 355-359.

[5] LI Xue-ming, LI Gu, XU Yuan-long, et al. Preparation of fenofibrate nanosuspension and study of its pharmacokinetic behavior in rats[J]. Drug Dev Ind Pharm, 2009, 35(7): 827-833.

[6] DENG Jie-xin, HUANG Leaf, LIU Feng. Understanding the structure and stability of paclitaxel nanocrystals[J]. Int J Pharm, 2010, 390(2): 242-249.

[7] SARNES A, STERGAARD J, JENSEN S S, et al. Dissolution study of nanocrystal powders of a poorly soluble drug by UV imaging and channel fl ow methods[J]. Eur J Pharm Sci, 2013(50): 511-519.

[8] GAO Lei, LIU Gui-yang, MA Jian-li, et al. Application of drug nanocrystal technologies on oral drug delivery of poorly soluble drugs[J]. Pharm Res, 2013 (30): 307-324.

[9] 陈海亭，尹蓉莉，陈金玉, 等. 星点设计-效应面法优化山楂叶总黄酮微孔渗透泵控释片处方[J]. 中成药, 2011, 33(10): 1688-1692.

[10] 刘艳杰, 项荣武. 星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J]. 中国现代应用药学杂志, 2007, 24(6): 455-457.

Abstract: ObjectiveTo optimize the formulation and preparation technology of gambogic acid nanosuspensions. Method The nanosuspensions were prepared by high pressure homogenization. The formulation was optimized by the central composite design-response surface methodology with repect to size, PDI and zeta potential, and the optimal formulation was verified. Result Gambogic acid nanosuspensions were prepared under the optimal condition. Under this condition, size, PDI and zeta were 258.7 nm, 0.186 and -28.9 mV, respectively. Conclusion The nanosuspensions optimized by design-response surface methodology have a reliable predictability.

Optimization of the formulation of Gambogicacid nanosuspensions by the central composite design-response surface methodology

ZHANG Wen-jun, WU Fan, WANG Xin, TAN Ya-nan, LI Yi, CHEN Li-jiang*
(School of Pharmacy, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

pharmaceutics; central composite design; gambogic acid; nanosuspensions; high pressure homogenization

R 94

A

（2014）02–0043–10

(本篇责任编辑：马丽丽)

2014–01–09

辽宁“百千万人才工程”资助项目(2012921024)；辽宁大学“大学生创新创业训练计划”(201210140003)

张文君(1989-)，女(汉族)，四川万县人，硕士研究生，E-mail jjll290@163.com；*通讯作者: 陈立江(1969-)，女(汉族)，湖南永州人，教授，硕士，主要从事药物新剂型及新技术的研究，Tel. 024-62202469，E-mail chlj16@163.com。