人不同孕期胎盘组织中实时荧光定量PCR内参基因的选择

赵 晶，赵俊杰，康丽丽，李亚清，王 斌，雷艳霞

(西安交通大学医学院：1. 第一附属医院血液科；2. 环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061；3. 长安区医院，陕西西安 710100)

实时荧光定量PCR(QPCR)是近年来最常用的快速、准确定量检测低丰度mRNA的敏感方法。使用内源性管家基因(housekeeping gene)作为内参照物进行校正和标准化，以去除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异，是QPCR中常采用的相对定量方法。3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)是最常用的管家基因。但是，近年来我们在研究中发现,在不同类型的细胞和组织、细胞增殖和器官发育的不同阶段、体外培养等各种实验条件情况下，它们的表达量通常变异较大。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现；另一方面可能导致错误甚至相反的结论。因此，选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是QPCR实验成功的关键。本文采用实时荧光定量PCR方法，分析了妊娠早、中、晚孕期及妊高征、子痫胎盘组织中GAPDH、β-actin、RNA聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、β2微球蛋白、18S核糖体RNA(18SrRNA)管家基因的表达，了解胎盘组织在发育的不同阶段及病理条件下上述管家基因的表达变异情况，选择出该研究的最适管家基因，为正确应用、PCR技术准确、真实的反映基因特异性表达提供技术支持。

1材料与方法

1.1研究对象选取2009年1月至2010年1月在西安交通大学医学院第一附属医院妇产科门诊非医学原因自愿要求人工流产的健康妇女绒毛组织(妊娠6～10周)20例；同期在该院妇产科住院自愿引产中期妊娠(妊娠16～28周)孕妇,采用剖宫取胎术或水囊引产术终止妊娠之胎盘组织15例；同期住院之正常晚期妊娠胎盘组织20例。研究对象均已签署知情同意书。

1.2标本处理经无菌负压吸宫术获得绒毛组织,胎盘娩出后立即剪取胎盘中央、脐带附着部周围胎盘组织母体面(避开钙化灶及机化灶)约1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm。立即放入1.5 mL Eppendorf管中(已预先经DEPC水处理)，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3试剂和仪器RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，荧光荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa Biotechnology公司。仪器为美国PE公司ABI Prisnxr7000荧光定量PCR仪。引物设计与合成由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司提供(表1)。

表1 内参基因引物序列

1.4方法

1.4.1RNA的提取 应用Trizol试剂盒，按说明书要求提取RNA，并用Nano Drop ND-1000分光光度计测定含量和纯度。A280/A260≥1.8为合格。所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28S、18S两条区带，证明其完整性。-70 ℃保存待用。

1.4.2cDNA的合成 逆转录反应采用Fermentas 公司反转录试剂盒[RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(K1621)]，按说明书操作。用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer测定cDNA含量与纯度，所合成的cDNA可直接用于PCR或于-20 ℃保存备用。

1.4.3荧光定量PCR 采用TaKaRa Biotechnology公司的 SYBY Premix ExTaqTMⅡ试剂盒，按说明书进行操作。反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 Cycles。同时，用经逆转录所获得的cDNA作为标准品,经系列稀释后(101～105)，与被检样本同时扩增，制备标准曲线，根据标准曲线计算被检样品的mRNA表达。

1.4.4内参基因RNA转录水平变化的比较及稳定性分析 内参基因RNA转录水平差异的比较直接用各样本的CT值比较。内参基因稳定性分析应用GeNorm程序分析软件，在Excel中设定不同样本中某一看家基因值最小者的表达量为1，其他样本此看家基因的相对表达量则为2-△CT(△CT=各样本CT值-最小CT值)。将这些数据导入Genom程序，计算各基因表达稳定度的平均值M，对管家基因表达稳定度进行排序，M值越小，表达越稳定。

2结果

2.1不同孕期组织内参基因mRNA的变化在早、中、晚不同孕期的绒毛或胎盘组织中内参基因GAPDH mRNA表达水平变化最大，其中在早孕绒毛组织中表达水平最高，随着孕期的延长其表达水平逐渐降低，标本间CT值变化范围17.11～30.12。内参基因β-actin mRNA转录水平则呈相反的趋势变化，标本间CT值范围变化亦较大(18.21～29.55)。内参基因β2-M、18S和UBC mRNA表达水平在不同孕期标本间变化相对较小，其中内参基因RPⅡmRNA表达水平在不同孕期标本间变化最小(CT值范围25.46～31.23，图1)。

图1 内参基因CT绝对值的变化

2.2内参基因的稳定性分析应用GeNorm程序分析软件对所选的内参基因进行稳定性分析及排序，内参基因GAPDH、β-actin、β2-M、18S rRNA、UBC、RPⅡ的M值分别为0.22、0.18、0.16、0.14、0.12、0.08(图2)。M值越小，基因表达稳定度就越高；反之，M值越大,基因表达稳定度就越低。因此，所选内参基因表达稳定度由高到低依次为RPⅡ>UBC>18S rRNA>β2-M>β-actin>GAPDH。

图2 内参基因表达稳定性的比较

3讨论

实时荧光定量PCR是基因表达分析研究中应用十分广泛的方法之一，选择表达稳定性高的内参基因的重要性已为大家所共识。近年来，研究人员对于多种组织中内参基因的表达稳定性进行了广泛研究[1-6]。结果提示，迄今为止适用于所有类型的细胞/组织所通用的内参基因可能不存在。研究者应根据所研究的细胞或组织寻找适合各自实验系统的特异性稳定表达的内参基因，以保证实验结果的可靠性。

目前，对某种基因表达的研究不再基于一个时间点和或一种组织[7]，基因表达谱和表达特性的相关研究已经成为热点。实时荧光定量PCR已广泛应用于妊娠期胎盘发育进展及疾病的基因表达发育性变化研究[8-10]，但在此类基因表达研究中，研究者多采用传统的管家基因(GAPDH、β-actin)作为内参，对目的基因进行标准化，但如果选择的内参基因在该组织中并不是稳定表达，可能对实验结果造成影响，导致基因表达检测结果出现误差或相悖。目前，尚未见妊娠期胎盘发育性变化过程中基因表达研究的有关内参基因选择的报道。在本研究中，作者采用实时荧光定量PCR方法检测了早、中、晚不同孕期绒毛或胎盘组织中6种内参基因(GAPDH、β-actin、RPⅡ、β2-MG、18S rRNA、UBC)mRNA转录水平的表达情况。结果表明，常用的内参基因GAPDH、β-actin RNA在不同孕期标本间表达差异明显，且表达变化趋势相反；GAPDH在早孕绒毛中mRNA表达水平最高，随着孕期的延长其表达水平逐渐降低，β-actin RNA转录水平则呈相反的趋势变化。如果分别采用GAPDH或β-actin作为内参基因对对目的基因进行标准化，可能对实验结果造成影响，导致基因表达检测结果出现误差或相悖。应用GeNorm程序分析软件对所选的内参基因进行稳定性分析及排序，在6种内参基因中，RPⅡ基因表达较为稳定，不同标本间变化较小，所选内参基因表达稳定度由高到低依次为RPⅡ>UBC>18S rRNA>β2-M>β-actin>GAPDH。结果提示，在对不同孕期及异常妊娠胎盘组织中mRNA转录水平基因表达研究时，不但生长调控相关基因呈现出显著的发育性变化，而且多种常作为内参基因的管家基因亦呈现出显著的发育性变化或差异表达特性。故在相关研究中，内参基因的选择就成为实验的关键和难点，如果不符合条件的看家基因被选择作为内参基因，将会直接影响目的基因表达的结果评估。在本研究中，传统的内参基因GAPDH和β-actin并不适合，RPⅡ是最有用的候选内参基因。

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