原料乳中三聚氰胺检测方法的改进

李雪，隋建中，李梅，杨文娟

1.新疆维吾尔自治区农产品质量安全监督检验中心，乌鲁木齐 830049 2.华润赛科药业有限责任公司，北京 100124

原料乳中三聚氰胺检测方法的改进

李雪1，隋建中1，李梅2，杨文娟1

1.新疆维吾尔自治区农产品质量安全监督检验中心，乌鲁木齐 830049 2.华润赛科药业有限责任公司，北京 100124

对国家标准GB/T22388-2008中高效液相色谱法检测原料乳中三聚氰胺的方法进行改进。改进后的方法，平均回收率为88.19%～91.31%，缩短了样品前处理时间，提高了样品添加回收率。

原料乳；三聚氰胺；高效液相色谱法；定量分析

三聚氰胺简称三胺，又称蜜胺、三聚氰酰胺，低毒，是一种重要的氮杂环有机化工原料。主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛应用于塑料、涂料、造纸、木材加工、医药和电器等工业。动物试验结果表明：动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，产生膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。2008年10月7日，国家质检总局、国家标准委员会发布了GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》。该标准中的高效液相色谱法是目前最常用的三聚氰胺检测方法，但是在采用该标准进行试验的过程中，发现添加回收率不理想。本研究针对前处理方法进行了改进，提高了方法的添加回收率，并总结出一些实践心得。

1 材料与仪器设备

1.1 试剂与溶液

1.1.1 试剂

乙腈、甲醇、辛烷磺酸钠均为色谱纯，氨水、三氯乙酸、柠檬酸均为分析纯，三聚氰胺标准物质（纯度大于或等于99.0%）。

1.1.2 溶液

甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。

氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。

乙酸铅溶液（22g/L）：取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L。

三氯乙酸溶液（1%）：准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

离子对试剂缓冲液：准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛烷磺酸钠，加入约980mL水溶解，调节pH至3.0后，定容至1L备用。

三聚氰胺标准贮备溶液：准确称取100mg三聚氰胺标准物质（准确至0.1mg）于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，4℃条件下避光保存。

三聚氰胺标准工作液：根据检测需要，用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到相应浓度标准工作液。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪（安捷伦1260，配紫外检测器），分析天平（感量0.0001g和0.01g）,pH计(± 0.02),离心机（转速不低于4000r/min），超声波水浴，氮吹仪，旋涡混合器，混合型阳离子交换固相萃取柱，离心管（50mL）。

2 试验方法

2.1 提取

称取2g（准确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再震荡提取10min后，以4000 r/min离心10min。取上清液5mL待净化。

2.2 净化

依次用3mL甲醇、5mL水活化固相萃取小柱。将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3mL水、3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液分两次洗脱。洗脱液于50℃下用氮气吹至近干，残留物用2mL流动相定容，旋涡混合1min，过微孔滤膜后，待测定。

2.3 高效液相色谱分离条件

色谱柱：C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：离子对缓冲溶液-乙腈（90︰10）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：240nm；进样量：10μL。

3 试验结果

3.1 方法的线性范围和相关性

对浓度为0.8mg/L、2mg/L、20mg/L、40mg/ L、80mg/L的三聚氰胺标准溶液分别进样，以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见图1）。结果表明，三聚氰胺在0.8～80 mg/L范围内呈线性相关。线性方程为y＝36.35x＋5.3094,相关系数为R2＝0.9998。

图1 三聚氰胺标准溶液标准曲线

3.2 回收率、精密度和最低检出限

依据噪声值，按3倍信噪比，计算其理论检出限，为0.212mg/kg。回收率测定结果见表1，精密度测定结果见表2。标准、空白及添加样品色谱图见图2至图4。

表1 加标回收率试验结果（n=5）

表2 精密度试验结果（n=5）

图2 三聚氰胺标样色谱图

图3 空白样品色谱图

图4 添加样品色谱图

4 讨论

国家标准在样品进行离心后，对上清液用润湿的滤纸过滤。试验表明在过滤时会造成三聚氰胺的损失，降低回收率。本研究显示：样品经过离心后直接取上清液进行净化，可以大大提高添加回收率，且对后续试验不会造成影响。另外，如上清液不经固相萃取柱净化，虽然回收率可以达到标准要求，但是长时间、大批量的检测任务会对仪器尤其是色谱柱造成不良影响。

用混合型阳离子交换固相萃取柱进行样品净化，由于洗脱样品过程中存在离子交换过程，所以洗脱速度不宜过快，要使洗脱液与萃取柱填充物充分接触，将三聚氰胺充分洗脱，从而得到理想的回收率。试验表明洗脱流速≤2.0mL/min时，可以保证理想的回收率。

通过反复试验，发现氮吹时如果将提取液完全吹干，样品的回收率十分不理想，所以在进行氮吹时不宜将样品提取液完全吹干。

本试验方法的平均回收率为88.19%～91.31%，精密度RSD＜2.96%(n=5),符合国家标准要求，准确度好，精密度高。与国家标准的高效液相色谱法比较，改进的方法提高了样品添加回收率，节约了处理时间。改进后的方法缩短了样品前处理时间，提高了样品添加回收率。

[1]王新娣，李莉，田兰，等.乳制品中三聚氰胺检测方法的改进[J].新疆医科大学学报，2010，33（3）:248-249.

[2]肖洋，粟周伟，冯永渝，等.原料乳中三聚氰胺的高效液相色谱法测定[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：45-46.

[3]田玉平，王东辉，郭卫荣.乳及乳制品中三聚氰胺的检测方法[J].化学世界，2009（8）：467-470.

[4]杨兴龙，周玮，丁红梅，等.高效液相色谱法测定蛋制品中三聚氰胺[J].理化检验-化学分册，2011，47（1）：97-98.

[5]汤桦，陈大舟，吴雪，等.高效液相色谱法测定禽蛋及其制品中的三聚氰胺[J].中国科学B辑：化学，2009，39（8）: 838-844.

[6]原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[S].北京：中国标准出版社，2008:2-4.

李雪（1981年12月—），新疆维吾尔自治区农产品质量安全监督检验中心，农艺师，主要从事农产品质量安全工作。

2014－02－18