利用正交试验优化苦马豆愈伤组织的诱导

郭刚

新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100

利用正交试验优化苦马豆愈伤组织的诱导

郭刚

新疆农业职业技术学院，新疆昌吉 831100

本研究采用正交试验方法，以苦马豆幼苗不同部位为外植体与较适愈伤组织诱导激素配比的筛选，探究不同外植体及激素组合对苦马豆愈伤组织诱导的影响。结果发现，苦马豆幼苗子叶为较适外植体，以MS为基本培养基，添加6-BA1.0mg/L+2,4-D0.50mg/L激素配比为较适配方，为苦马豆组培工厂化育苗奠定基础。

苦马豆；外植体；愈伤组织；正交试验设计

苦马豆[Swainsonasalsula（Pall.)DC]隶属豆科苦马豆属植物，别名羊尿泡，属多年生草本或小乔木[1]。以全草、根、果实入药，具有利尿、消肿、降压等功效，主要分布于中亚及我国西北地区，我国仅有一属一种[2～4]。

苦马豆的次生代谢产物—苦马豆素,具有抗肿瘤、抗AIDS病毒和增强肌体免疫力的活性[5～6]，有可能成为一种很有前途的肿瘤治疗辅助药物,因而备受关注。西北农林科大博士生导师曹光荣教授认为苦马豆素最大的优势在于，在杀死癌细胞的同时，对人体免疫系统具有保护作用，毒副作用极其微弱。同时，苦马豆素用于抑制肿瘤将使珍稀濒危药材——紫杉醇有了来源广泛的替代品[7]。

近年，过度放牧、过度农垦和不合理采集地下水资源等原因导致土地沙漠化，生态环境日益恶化，植被遭到破坏，而且采集和消耗苦马豆的数量已经超过野生苦马豆资源的再生能力，野生苦马豆资源数量急剧下降，日趋匮乏。目前，前人对其无性再生研究已有报道，但对愈伤组织诱导体系优化筛选的文献未见有详细报道，笔者在前人研究的基础上，研究意义：一是利用正交试验设计方法进一步探讨不同外植体及激素配比对苦马豆愈伤组织诱导的影响，筛选较有利于愈伤组织诱导的外植体及培养基激素配比，以建立并优化苦马豆愈伤组织诱导体系；二是，已报道一些黄酮类成分已从该植物的全草中分离到，但从离体培养的愈伤组织中分离出有效药用成分未见报道，故本试验的结果对苦马豆愈伤组织细胞的离体培养和其代谢产物的研究有一定参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

苦马豆种子（采集于新疆昌吉市二六工镇），经过浸泡处理，剥去种皮，平铺在垫湿润滤纸的培养皿中，在23℃恒温培养箱中培养，幼苗生长至5～6cm时，无菌处理，取上胚轴、下胚轴、子叶切段作为试验材料。

1.2 试验设计

试验采用MS为基本培养基，采用L9（34）正交设计，每个设计安排9次试验。试验因子及水平安排见表1，其中A为外植体，B为6-BA，C为2，4-D，D为光照。共9个处理，每处理接种10瓶，每瓶接种4块外植体。接种后42d统计结果，并进行极差分析。

表1 L9(34)因子水平

1.3 试验方法

1.3.1 无菌材料的获得

无菌苗培养，挑选饱满成心形的种子用浓硫酸浸泡20min，用自来水清洗，在超净工作台中紫外光杀菌15min，升汞消毒15min，无菌水冲洗5～6遍，75%酒精浸泡20s，再用无菌水冲洗4～5遍，接种在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上，5d后长出幼苗。

1.3.2 外植体接种

无菌条件下将子叶和胚轴剪成1～2cm小段，分别接种在9个处理中，每个处理设10次重复，每瓶接种4个外植体，以探索不同种类、不同浓度激素对苦马豆愈伤组织诱导的影响。

1.3.3 外植体人工培养

将无菌接种的外植体分别培养于25±1℃，的光照培养室和人工暗培养箱中，光照强度1500～2 000lx，光照时间14h/d。

1.3.4 观察与记录

每隔10d观察、记录1次。其中：愈伤组织诱导率=长愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%。

2 结果与分析

苦马豆接种15d观察到外植体切口处开始扭曲、肿胀，有愈伤组织萌动的迹象；第18d肿胀明显，表面呈疙瘩状突起，并形成少量愈伤组织；第27d整个子叶愈伤化，并形成大量愈伤组织；第37d白绿色愈伤组织大量增殖，基本见不到原接种外植体。第37d调查的愈伤组织诱导率，L9 (34)正交试验结果见表2。

表2 L9(34)正交试验结果

根据表2得知，苦马豆愈伤组织诱导各因素水平的最优水平组合为A1B2C2D2。，即最适外值体为上胚轴，最佳诱导培养基为MS+6-BA1.0mg/ L+2,4-D0.50mg/L，最佳光照为白光：由极差R值可看出，在该试验中B为主导因素，4个因子对苦马豆愈伤组织诱导的影响程度依次为：6-BA＞2,4-D＞外植体＞光照。

3 结论与讨论

3.1 愈伤组织的诱导与外植体的生理成熟度有关

外植体的选择在理论上，任何具有生命力的植物的组织或器官都具有育成完整生物个体的潜在能力，都能作为外植体进行组织培养，但研究表明，植物种类以及发育阶段、年龄、生理状态、外植体的大小、外植体在树体和枝条上的位置、外植体的采集时间、季节等不同，其无性繁殖的能力也不一样。同一种植物不同的组织和器官其再生能力也有很大差异[8]。

该试验以苦马豆无菌幼苗上胚轴、下胚轴、子叶为外植体，试验结果表明，苦马豆幼苗上胚轴的愈伤组织诱导率最高，这与上胚轴自身含有部分天然生长激素有关。可见，愈伤组织的诱导与外植体的生理成熟度密切相关。

3.2 培养基激素配比

细胞分裂素和生长素的配比对苦马豆愈伤组织诱导起着非常重要的作用，在该试验中，2个激素因子对苦马豆愈伤组织诱导均产生影响，2，4-D对苦马豆愈伤组织的诱导起到明显的促进作用。在苦马豆愈伤组织的诱导中生长素与细胞分裂素最佳浓度配比为6-BA1.0mg/L+2，4-D0.50mg/L。

3.3 光照条件

同波长的光对器官脱分化和细胞分裂有影响，光质通过调节关键酶活性来调节糖分解的快慢，从而调节ATP、NADPH和其他合成代谢所需的小分子物质的产生，以适应生理需要[9]。该研究中，在白光光照条件下苦马豆脱分化产生愈伤组织细胞较快且生长量较多，红、蓝光次之，暗培养对苦马豆愈伤组织产生的作用最小。

本试验中药用植物苦马豆高效组织培养技术的建立为后续各种科技研究工作提供了相应平台，如利用现代生物技术离体悬浮培养苦马豆愈伤组织，研究其代谢抗肿瘤新药苦马豆素的路径和生理调控。

[1]马金双.关于苦马豆属学名的讨论[J].云南植物研究，1991，13（4）:380-382.

[2]王进,王桔红,张勇,等.苦豆子和苦马豆种子特性及硬实破除研究[J].中药材，2011，34（5）:670-673.

[3]周吉林,伍春莲,陈卫英.光照及黑暗条件下不同浓度2，4-D对诱导苦马豆愈伤组织的影响[J].内江师范学院学报，2009，24（12）:41-44.

[4]崔小蓉,刘慧,杨军.钙盐胁迫下苦马豆愈伤组织生理指标研究[J].西华师范大学学报(自然科学版)，2011，32（3）: 259-263.

[5]杨鸣琦.苦马豆素对小白鼠移植性肿瘤S180，ARS的抑制试验[J].动物医学进展，1998，19（2）:26-29.

[6]吴达，梁冰，冯志刚，等.苦马豆素研究进展[J].中兽医医药杂志，2003，22（2）:42～45.

[7]毛海峰.2003.当代健康报[N].2003.7:17.

[8]薛春丽，郭俊明，李铁梅.L9（34）正交试验设计对白花蛇舌草愈伤组织诱导方案的优化[J].安徽农业科学，2010，38（21）：11122—11123.

[9]王亚丽，王晓东，赵兵，等.光质对玛咖愈伤组织生长、分化的影响[J].过程工程学报，2007，7（4）：782-785.

郭刚（1977年—），讲师，硕士，研究方向为植物抗逆生理与药用植物组培。

新疆自然科学基金项目（2011211A087）。

2014-02-27