免疫荧光法在微生物快速检验中的应用研究

艾春英

免疫荧光法在微生物快速检验中的应用研究

艾春英

目的探讨免疫荧光法在呼吸道感染患者快速检测中的临床应用效果。方法采用免疫荧光法对2011年9月~2013年9月本院所接受治疗的200例上呼吸道感染患者鼻、咽分泌物标本进行快速检验, 检测呼吸道感染患者感染病毒种类及其感染率。结果200例患者中, 病毒感染阳性者178例, 病毒感染率为89%。包括呼吸道合胞病毒阳性者24例, 腺病毒者49例, 流感病毒A、B者各38例、29例, 副流感病毒1、2、3各10、16、12例, 感染率分别为13.48%、27.53%、21.35%、16.29%、5.62%、8.99%、6.42%。上呼吸道感染患者中病毒感染者占绝大多数, 其中尤以腺病毒感染率最高。结论免疫荧光能快速检测患者病毒感染种类且敏感性高, 为上呼吸道感染患者治疗有良好的效果, 值得临床推广使用。

免疫荧光法；上呼吸道感染；病毒检验

免疫荧光技术是指应用将抗原和抗体相结合的生物反应与形态学相结合的原理, 把血清学特异性、荧光色素的敏感性和显微镜检查法融为一体。该方法由于特异性强、敏感性高、速度快成为今年来诊断学应用越来越广的手段之一。目前已经应用于多种病毒、细菌、真菌的快速检测中。急性上呼吸道感染95%以上均为病毒感染所引起, 主要常见的有呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒等［1］。本文采用免疫荧光法检测对200例上呼吸道感染患者进行快速诊断, 以对患者感染病毒种类进行快速诊断, 结果报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究所有对象均来自电子科技大学医院2011年9月~2013年9月呼吸科所接受治疗的上呼吸道感染患者200例, 包括男性128例、女性72例, 年龄在3~80岁之间, 平均年龄为(56.4±2.8)岁。包括喉部感染患者38例、咽部感染者69例、鼻部感染者93例。有13人并发急性心肌炎、10人伴有肾炎、8人并发风湿热症。

1.2研究方法

1.2.1检测试剂 本研究共使用7项病毒荧光检测试剂盒,均由美国DHI公司提供, 包括：荧光标志抗体试剂盒, 荧光标志的单克隆抗体试剂盒, 针对呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型试剂盒。除此之外还有浓缩洗涤液(40×), 封闭液、病原体相关对照玻片(包括阳性对照记阴性对照的点样孔)。

1.2.2检测方法 标本的收集及处理：①采取负压吸引器先将患者鼻、咽、喉部的分泌物, 大约2~3 ml, 将分泌物移至无菌生理盐水中。②反复吹打分泌物, 移至离心管中。③离心除去上清液, 转速500 r/min, 时间为8 min。④将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤, 混匀。⑤重复离心步骤, 除去上层,重复直至上清液不在粘稠。⑥将最后一次离心的沉淀溶解于0.5~1 ml磷酸盐缓冲盐溶液中, 吹打使其成为细胞悬液。⑦在病原体对照玻片中每孔点入25 μl的细胞悬液。⑧使点样孔风干, 再用冷丙酮固定10 min。

荧光染色：主要包括3个步骤, ①在对照玻片样孔中的细胞中滴加上1滴相对应的荧光抗体20 μl, 于37℃保湿盒中孵育0.5 h。即1~7号样孔中一次滴加荧光标志抗体作阴性对照, 荧光标志单克隆抗体做阳性对照, 以及呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型试剂盒作样品孔。②用洗涤液将玻片中细胞洗涤数次,数次之后再用蒸馏水洗涤1 min。③待蒸馏水风干后将玻片孔中滴加入1滴封闭液, 盖上盖玻片, 再用荧光显微镜观察。

1.3诊断原则及判断的依据 ①诊断原则：被荧光标志的相对应病毒特异性单克隆抗体与其抗原结合后, 形成结合复合物, 在荧光显微镜下可见绿色荧光, 而未被染色的则会被Evans蓝染为红色。② 阳性结果判断标准：荧光显微镜下显示绿色荧光为阳性, 无荧光为阴性, 当在显微镜放大倍数为200时, 有≥2个荧光细胞则认为标本为阳性。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0数据统计分析软件对所获数据进行分析, 统计患者各种病毒种类感染例数及相应感染率。

2 结果

在所研究的200例患者中, 患者各种病毒感染数据如表1所示。

表1 上呼吸道病毒感染患者感染种类及感染率(n=178)

3 讨论

免疫荧光法主要使用的试剂为患者血清以及其免疫荧光抗体。该试验要求试剂对关键的部分抗原应具有高度的特异性, 即单特异性抗体制剂［2］。近年来, 在人工合成免疫原方面取得了进, 经研究判明, 沙门氏菌的群特异性抗原决定簇是一种双糖［3］。于是, 人们用人工方法合成高纯度的这种双糖, 再与蛋白质结合成免疫原, 就可制出群特异性极强的单特异性抗体, 新近发展起来的制备单克隆抗体的技术, 也为制备各种单特异性抗体开辟了广阔的道路［4］。

本研究通过将免疫荧光法应用于近两年本院接收治疗的上呼吸道感染患者200例, 通过对患者细胞标本与相对应的抗体作抗原抗体反应, 通过反应阳性与否判断患者相对应的感染病毒种类。通过试验结果显示, 200例患者中有178例患者病毒感染阳性者178例, 病毒感染率为89%。呼吸道和胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B, 副流感病毒1、2、3感染率分别为13.48%、27.53%、21.35%、16.29%、5.62%、8.99%、6.42%, 结果准确且快速。免疫荧光法能够 准确且快速的检测出患者感染呼吸道的种类, 效果可靠。该方法能够在实验室内2 h时间且在仅需要荧光显微镜的设备以及相对应试剂盒下即可检测出患者感染病毒种类, 且简单、廉价, 能为一般实验室所开展。

总之, 免疫荧光技术用于微生物学快速检验已初露锋芒,目前还在不断与其它先进技术结合, 逐渐发展得更加完善。

［1］ 唐盛, 林恒先, 龚海涛, 等.免疫荧光法检测奈瑟氏淋球菌方法的建立及其临床应用评价.标记免疫分析与临床, 2011, 18(2): 107-110.

［2］ 金之瑾, 陈健, 顾志芬, 等.间接免疫荧光法在弓形体检测中的临床应用.第六届全国优生科学大会论文汇编, 2006(01): 147-149.

［3］ 黄秋林, 许翔, 蒋淑芳.直接免疫荧光法对多种呼吸道病毒检测的临床意义.检验医学与临床, 2008, 5(3):135-137.

［4］ 颜善活.免疫荧光检测C-反应蛋白的临床应用分析.中国临床新医学, 2010(30):19-21.

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