湘西黄牛IGF–IR 基因的群体遗传多态性及其 与生长性状的关联分析

王兴平，罗仍卓么，欧阳助姣，李峰，李娜，王京仁

(1.湖南文理学院生命科学学院，湖南 常德 415000；2.湖南省高校动物学重点实验室，湖南 常德 415000)

湘西黄牛是湖南省优秀的地方家畜品种，主产于湖南省湘西北地区，耐粗饲，耐热，其肉质富含蛋白质和必需氨基酸，脂肪含量适宜，营养全面[1–3]。但是，湘西黄牛体型较小，生长发育缓慢，产肉率较低，严重制约了湘西黄牛产业的经济效益。为提高湘西黄牛生长发育速度和产肉率，同时保持其优良肉质，国内研究者已经对湘西黄牛的微卫星多态性[4–5]和MC3R[6]、SST[7]、H–FABP[8]、LPL[9–11]等功能基因的多态性与生长性能的关联进行了探索，结果表明，上述基因的部分多态性位点与湘西黄牛的生长性状相关。但是，这些位点还不足以进行分子育种，更多的标记位点有待于进一步挖掘。

胰岛素样生长因子I 受体(IGF–IR)是胰岛素样因子家族(IGFs)的重要受体，通过与IGF–I 结合，共同介导生长激素(GH)的促生长信号通路，在哺乳动物细胞分化与增殖、胚胎发育、神经发育、骨骼肌和骨骼发育等过程中起着重要的调节作用[12–16]。迄今为止，未见湘西黄牛IGF–IR 基因分子遗传特征与生长性状相关的研究报道。本试验采用PCR 扩增及PCR–RFLP 技术，分析了IGF–IR 基因在湘西黄牛群体中的遗传变异及分子遗传特征，并对多态位点与湘西黄牛的生长性状进行了关联分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试牛

在湖南省常德地区随机选择205 头湘西黄牛母牛，经颈静脉采集每头牛的血液，并对牛进行口齿年龄鉴定和生长性状指标(体重、体高、体斜长和胸围)的测定。

1.1.2 试 剂

Taq DNA聚合酶、Taq I限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司； DNA快速纯化试剂盒、dNTP混合物、DNA Marker II购自天根生化科技(北京)有限公司；100 bp ladder plus Marker购自北京博凌科为生物科技有限公司。

1.1.3 引 物

引物(F:CCCA ATGGATTGATCCTCATGT；R: GCTGTGTAGTTCCC TGGGTT)[12,17–19]，用于扩增IGF–IR基因序列，包括12号外显子(exon12)部分序列、12号内含子(intron12)全序列及13号外显子(exon13)部分序列预期扩增长度为616 bp。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA 提取

颈静脉采集2 mL湘西黄牛血液，离心，收集细胞，加血样裂解液、SDS和蛋白酶K共计1 mL以裂解细胞，并采用等体积的酚/仿抽提牛基因组DNA[20]，TE缓冲液溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度，–20 ℃保存，备用。

1.2.2 PCR 扩增

用205头湘西黄牛样本的DNA为模板分别进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)为：10×Buffer(含Mg2+) 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶0.3 μL，DNA 1 μL，超纯水15.2 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；35个循环(94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s)；终延伸10 min。产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后分别用DNA快速纯化试剂盒纯化。

1.2.3 SNP 筛查

随机挑选4头湘西黄牛的PCR产物纯化样品，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，其序列与已公布的安格斯牛IGF–IR基因序列(GenBank登录号为JQ924783)进行多序列比对，确定湘西黄牛SNP数目、突变类型及SNP的位置。将获得的SNP与现有文献资料和SNP数据库进行比较，以确定湘西黄牛IGF–IR基因的新SNP。

1.2.4 RFLP 与基因分型

根据SNP酶切位点的分析结果，确定基因分型位点及RFLP分析用限制性内切酶，对纯化后的PCR产物进行酶切。酶切体系为：PCR纯化产物3 μL，10×限制性内切酶Buffer 1 μL，0.1% BSA 1 μL，限制性内切酶0.5 μL，灭菌双蒸水4.5 μL，65 ℃水浴8～10 h。酶切产物用4%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。根据条带初步判断基因型，并以初步判断的纯合子个体的基因组DNA为模板分别进行PCR(反应条件同上)。PCR产物纯化后送生工生物工程(上海)有限公司测序，验证基因分型的准确性。

1.2.5 数据统计

用POPGENE1.31软件对基因频率和基因型频率、多态信息含量、群体杂合度、有效等位基因数和Hardy–Weinberg平衡χ2检验进行统计。根据影响牛生长性状的因素，在对基因型与表型性状的关联分析时采用了固定模型：Trait(生长性状)=µ(均值)+A(年龄)+G(基因型)+e(随机残差)，运用SAS (Statistical analysis system) 8.2 软件GLM程序，分析标记基因型对生长性状的影响，并采用文献[21]的方法估计基因效应。

2 结果与分析

2.1 IGF–IR 基因的扩增结果

PCR产物的电泳结果如图1所示。结合测序结果可知，PCR扩增产物长度为616 bp，其在IGF–IR基因序列(GenBank登录号为JQ924783)中的位置为第95～710 bp。

图1 湘西黄牛IGF–IR基因的PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis patterns of PCR product for IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.2 IGF–IR 基因SNP 分析结果

多重比对结果表明，湘西黄牛IGF–IR基因部分序列中存在34个SNPs(表1)，其中32个SNPs位于intron 12，2个SNPs位于exon 13；插入突变2个，缺失突变2个，转换突变23个，颠换突变7个；exon 13中的2个SNPs(g.659 C＞T和g.668 T＞C)均属于酪氨酸的同义突变。34个SNPs中，除了g.551G＞T位点有文献[12,17–19]报道外，其余33个SNPs均未见相关文献报道，也未有在SNP数据库中收录。

表1 湘西黄牛IGF–IR基因SNP筛查结果Table 1 SNPs identified within IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.3 IGF–IR 基因g.551G>T 位点的RFLP 基因分型

在上述34个SNPs中，仅有g.551G＞T位点能被Taq I内切酶所识别，且在其他牛品种上有相关的文献报道[12,17–19]。为了能够与其他牛品种群体遗传多态性进行比较，揭示湘西黄牛群体遗传特征，本研究选择g.551G＞T位点进行群体遗传多态性分析。

PCR产物的TaqI内切酶(识别TˆCGA序列)酶切产物的结果(图2)显示，该位点在湘西黄牛群体中共出现3种基因型，分别为AA型(569、47 bp)，AB型(569、408、161、47 bp)和BB型(408、161、47 bp)。纯合子基因型测序结果(图3)表明，3种基因型的PCR产物的47～50 bp处均存在Taq I限制性内切酶识别位点。

图2 酶切产物的电泳结果Fig. 2 Electrophoresis and genotyping for PCR product digested by Taq I

图3 纯合子个体的PCR 产物测序结果Fig. 3 Sequecing results of PCR products from individuals with IGF–IR genotype AA and BB

2.4 IGF–IR 基因g.551G>T 位点的群体遗传特征

IGF–IR 基因g.551G＞T 位点的群体遗传特征统计结果见表2。3 种基因型分布频率的高低顺序为AB、AA、BB。A 为优势等位基因。多态信息含量为0.363 7(介于0.25～0.50)。从杂合度和有效等位基因数可看出，g.551G＞T 位点在湘西黄牛群体中处于中度多态性，并且已经达到了Hardy–Weinberg 平衡状态(P＞0.05)。

表2 湘西黄牛IGF–IR 基因g.551G>T 位点的群体遗传特征Table 2 The population genetic characters of g.551G>T locus in IGF–IR gene in Xiangxi cattle

2.5 IGF–IR 基因g.551G>T 位点多态性与生长性状的关联分析

差异显著性检验结果(表3)表明，湘西黄牛3种基因型个体的体高、体长、胸围和体重差异均不显著(P>0.05)。等位基因效应结果(表4)表明，A 等位基因对湘西黄牛的体高、体长、胸围和体重4 个性状均为正效应，而B 等位基因均为负效应。综上结果可知，A 等位基因虽然对生长性状均有正效应，但其影响均不显著，因此，从生物统计的角度判断，g.551G＞T 位点不适合作为湘西黄牛生长性状的分子标记位点。

表3 IGF–IR 基因g.551G>T 位点不同基因型及等位基因对湘西黄牛生长性状的影响Table 3 The effects of g.551G>T locus in IGF–IR gene on growth traits in Xiangxi cattle

表4 IGF–IR 基因g.551G>T 位点对湘西黄牛生长性状的等位基因效应Table 4 The Effective of different alleles of g.551G>T locus in IGF–IR gene on growth traits in Xiangxi cattle

3 讨 论

本试验用文献[12,17–19]中的引物扩增了湘西黄牛的IGF–IR基因部分序列，长度为616 bp，与GenBank 中收录的安格斯牛的序列长度相同(JQ92478)。但是用同样的引物从郏县红牛、秦川牛、南阳牛、安格斯、荷斯坦牛、西门塔尔杂交牛、安格斯杂交牛和Najdi牛中扩增出的PCR产物长度均为625 bp[12,17–19]。

迄今为止，SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/snp/?term=IGF1R+bos)收录了2 233个牛IGF–IR基因的SNPs，可见牛IGF–IR基因具有丰富的遗传多态性。本试验所检测到的34个SNPs均未包含在该数据库中，而仅有g.551G＞T有相关文献[12,17–19]报道。说明除了g.551G＞T之外的33个SNPs均为笔者新发现的SNPs，该结果也说明湘西黄牛群体中IGF–IR基因具有丰富的遗传多态性，可作为揭示湘西黄牛群体遗传特征的候选基因。

本试验PCR–RFLP的结果表明，湘西黄牛与其他牛[12,17–19]IGF–IR基因g.551G＞T位点的群体遗传多态性有以下差异：①酶切片段长度有差异。湘西黄牛在该位点存在3种基因型：AA型(569、47 bp)，AB型(569、408、161、47 bp)和BB型(410、170、47 bp)，而郏县红牛、秦川牛和南阳牛等品种[12,17–19]中的3种基因型则分别为AA型(580、45 bp)，AB型(580、410、170、45 bp)和BB型(410、170、45 bp)，这种差异是由IGF–IR基因序列长度差异所造成的。②基因型分布频率与部分牛品种有差异。湘西黄牛3种基因型分布频率的高低顺序为AB、AA、BB，与Curi等[17]报道的基因型分布的趋势相同，而Zhang等[18]报道郏县红牛、秦川牛和南阳牛群体中3种基因型分布频率的高低顺序为AA、AB、BB，其中BB型个体数量很少。经分析发现，湘西黄牛AA和AB的基因型频率与上述牛基因型频率分布存在显著差异(P＜0.05)，而BB基因型频率分布差异不显著(P＞0.05)。③等位基因频率分布有差异。湘西黄牛A和B等位基因的频率分别为0.609和0.3902。经分析发现，湘西黄牛与Nellore、Canchim牛群体[17]的A和B基因频率分布没有显著差异(P＞0.05)，而与西门塔尔杂交牛和安格斯杂交牛[17]、郏县红牛、秦川牛和南阳牛[18]、荷斯坦牛和Najdi牛[19]群体的A和B基因频率分布存在显著差异(P＜0.05)。群体遗传特征表明，湘西黄牛群体的IGF–IR基因g.551G＞T位点处于中度多态，且在群体中达到了Hardy–Weinberg平衡状态(P＞0.05)，说明该位点不适合用于分子标记辅助育种。 研究 表明，1周岁牦牛IGF–IR基因exon 1的SSCP多态位点的EE型个体的胸围、体斜长、体重等显著高于EF和FF型个体(P＜0.05)，而对于成年牦牛没有影响。Szewczuk等[23]研究表明，牛IGF–IR基因rs41640706/MspI位点(A/G)的GG型个体的断奶重显著高于AG型个体(+5.06 kg)。对于IGF–IR基因g.551G＞T位点而言，该位点的RFLP/TaqI不同基因型对南阳牛生长性状影响不显著[12]。上述文献结果显示，IGF–IR基因多态性对不同牛品种(或在同一品种的不同发育阶段)生长性状的影响效果不同。为了进一步确定IGF–IR基因多态性对湘西黄牛生长性状的关系，笔者进行了g.551G＞T位点的关联分析，结果表明，g.551G＞T位点的多态性对湘西黄牛群体的体高、体长、胸围和体重均无显著影响(P＞0.05)，表明g.551G＞T位点可能与湘西黄牛的生长性状QTL没有连锁关系，不适合作为湘西黄牛生长性状的分子标记位点。

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