花生HIR基因的克隆表达与进化分析

刘羽　传志　长生　翠　兴军

摘要：过敏性反应是植物抗病机制中最常见的形式之一。过敏性诱导反应（Hypersensitive-induced reaction）基因HIR是与过敏反应相关的一类基因，属于PID家族成员，参与许多细胞生理过程，并与细胞程序化死亡有密切关系。本研究从花生转录组文库中筛选到编码HIR基因的部分序列，通过5′-RACE获得花生HIR基因的全长cDNA序列，并克隆了其基因组序列。分析表明，花生HIR基因与其他物种HIR基因具有高度同源性。对6个物种共17条HIR序列使用最大似然法进行进化分析表明，该基因在进化中受到了强烈的纯化选择作用。qRT-PCR分析发现，该基因的表达量在冷处理4 h时显著降低，随着处理时间延长其表达量逐渐回升；在病菌处理的材料中该基因的表达下调。这些结果为进一步研究HIR基因在花生抗病、耐逆中的功能奠定了基础。

关键词：花生；HIR；基因表达；抗逆；抗病；纯化选择

中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0001-06

病菌侵染植物后会诱导相关基因的表达，引起物质积累和代谢途径的改变，进而使植物表现出一系列的生理反应。植物依赖两个免疫机制来对抗病原：病原物相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity， PTI）和效应子触发的免疫（Effector-triggered immunity， ETI）[1]。在PTI途径中，植物基于病原体分子的进化保守性来提供基本的免疫力；在ETI途径中，植物通过识别病原体的非毒性Avr基因产物，激活抗性基因，产生过敏反应（HR），在细胞内激活一系列反应，包括活性氧的产生、胞内离子流的变化、细胞膜功能紊乱等[2，3]。HR反应导致感染部位细胞迅速死亡从而阻止病原体的蔓延，HR蛋白通过诱导HR反应，在植物抗病性上起着重要作用[4]。

过敏性诱导反应基因（HIR）是与HR反应相关的一类基因，他们属于PID（Proliferation， ion channel regulation， and death）家族成员，PID蛋白由防卫反应基因抑制素Prohibitins和Stomatins两类蛋白组成。PID家族蛋白参与许多细胞生理过程，包括离子通道调节、细胞死亡等[5～8]。1998年，Karrer等[9]在烟草中最早鉴定出HIR基因，并证明该基因能够在叶片中诱导PR2的表达，产生组织坏死，该基因被命名为NG1。随后，Nadimpalli等[5]根据NG1氨基酸序列，在玉米中鉴定出Zm-HIR1、Zm-HIR2和Zm-HIR3三个基因。2003年，Rostoks等[10]在大麦中克隆到了Hv-HIR1、Hv-HIR2、Hv-HIR3和Hv-HIR4四个基因，其中Zm-HIR3和Hv-HIR3基因在模拟病原侵害自发坏死的突变体上出现了明显的上调表达，证明HIR不仅在双子叶植物中通过参与HR反应诱导细胞死亡及抗病功能，在多种单子叶植物中同样参与HR反应。Jung等[11，13]将辣椒的CaHIR1和水稻的OsHIR1在拟南芥中过表达，引起了类似HR反应的组织坏死，提高了对细菌及真菌的抗性，且证明CaHIR1在胡椒抵御渗透胁迫中也发挥了重要作用。Choi等[12]发现CaHIR1在植物抗病及免疫过程中是参与植物细胞死亡的正调节蛋白。HIR基因已从许多植物中克隆到，花生是我国重要的经济作物，目前，在花生上尚未见HIR基因克隆的报道。

1材料与方法

1.1材料与处理

本研究选用花生品种鲁花14号，于光照培养箱中培养，光照时间16 h，温度28℃；黑暗8 h，温度26℃。青枯病菌在含有红四氮唑（TTC）的NA培养基中培养，用无菌水悬浮菌液至OD600=0.6。使用Tseng等[14]的方法侵染两周龄花生的根，以水处理为对照。侵染48 h后将根切下，液氮速冻后于-80℃保存备用。选用两周龄花生苗进行4℃低温处理（处理6、12、24、48 h），对照材料在25℃条件下培养，每日光照16 h，处理24 h后将叶片切下，液氮速冻后于-80℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1花生总RNA提取和cDNA合成总RNA提取使用改良的CTAB法。用Eppendorf Biophotometer Plus型核酸蛋白检测仪检测RNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。cDNA的合成参考TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明进行。

1.2.2AhHIR全长cDNA克隆从本实验室花生果针转录组数据中获得一段长为656 bp的EST序列，BLAST分析表明，该序列与大豆HIR（JN083835.1）具有高度同源性，其开放阅读框不完整，5′端缺失约450 bp。根据该序列设计5′-RACE引物TSP1和TSP2（表1），通过Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒进行5′-RACE扩增，PCR程序为：第一轮：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25个循环；72℃ 5 min。以第一轮PCR 产物为模板进行第二轮PCR 扩增，PCR程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 5 min。分析测序结果后设计引物HIROF和HIROR（表1），以花生cDNA为模板克隆AhHIR的完整ORF序列。

1.2.3AhHIR基因组序列的克隆和测序分析取干净新鲜花生种子约500 mg， 采用CTAB法提取并纯化基因组DNA。利用引物HIROF和HIROR，扩增AhHIR的基因组序列，测序后与cDNA序列比对，验证其是否为AhHIR的基因组序列。

1.2.4AhHIR的qRT-PCR分析qRT-PCR 反应以花生根和叶不同胁迫处理的cDNA作模板，以花生Actin基因为内参，以HIRQF和HIRQR为引物（表1），采用FastStart SYBR Green试剂盒（Roche）进行扩增。反应程序为：预变性95℃ 10 min；两步法扩增95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；测定溶解曲线95℃ 15 s，60℃ 15 s， 95℃ 15 s。每个反应均设3 次重复。根据溶解曲线检测PCR产物的特异性。基因表达水平测定使用相对表达，通过2-△△CT方法计算。

1.2.5AhHIR的生物信息学分析AhHIR基因编码蛋白预测使用EMBOSS Transeq（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/），跨膜区预测使用TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。使用NCBI在线工具BLAST和Phytozome下载与AhHIR同源的16条核酸和蛋白序列，用ClustalW软件对其进行多序列比对，使用Mrbayes软件进行进化树构建，用Evoview绘制进化树，使用PAML软件包进行适应性进化分析，用Swiss-Model预测AhHIR蛋白三级结构模型，使用PFAM数据库检验预测模型，使用Swiss-PDBviewer标记氨基酸位点。

1.2.6AhHIR的进化分析对与花生AhHIR同源的16条核酸序列，用ClustalW软件进行核酸碱基序列对位排列，并对部分序列进行手动修正。使用MrBayes3.1.2软件经贝叶斯模型进行系统进化分析[21]，模型中参数使用默认值，共运行1 000 000代，每1 000代取样一棵树，去除前10 000代老化样本，剩余样本构建最终进化树。使用上述贝叶斯树文件和序列重排文件作为输入样本，每条序列存在304个氨基酸位点，使用PAML软件包内的模型：M0、M1a、M2a、M3、M7和M8进行进化分析[22]。

2结果与分析

2.1AhHIR基因的克隆

RACE扩增结果见图1A，经测序、序列拼接后设计引物，扩增AhHIR的完整ORF及基因组序列，分别获得了900 bp和1 900 bp的PCR产物（图1B和图1C），经测序证明所克隆的序列均为花生HIR。该基因由5个外显子和4个内含子组成（图2）。

2.2AhHIR的表达分析

qRT-PCR结果（图3）表明，4℃处理6 h后，叶片中AhHIR表达出现明显的下调，表达水平只有对照的20%，但随着处理时间的延长，AhHIR表达量逐渐升高，冷处理12 h后表达水平恢复到对照的47%，处理48 h后恢复到对照的76%。青枯病菌侵染48 h后根中AhHIR表达量下调约30%。

2.3AhHIR蛋白序列分析

用EMBOSS Transeq对AhHIR基因编码的蛋白序列预测表明，该基因编码288个氨基酸。将预测的花生HIR蛋白序列与其他5个物种的16条HIR蛋白序列使用ClustalW进行同源比对，发现不同物种间HIR同源性很高，达95%以上，其中花生与大豆和菜豆亲缘关系最近。根据TMHMM预测结果，花生HIR蛋白存在跨膜区的概率小于0.1%，存在膜上的概率小于5%，推测该蛋白应存在于胞质中。该蛋白与其他同源蛋白相似，N端有一个十四酰化的甘氨酸，可将蛋白锚定到质膜上[10]。

2.4AhHIR的系统进化分析

选用包括花生在内的6个物种共17条HIR基因序列，根据贝叶斯模型构建进化树（图4），结果显示整个进化树的枝长较短，这与HIR基因的高度保守有关。根据进化树各枝遗传距离，将其分为三种类型（在进化树中分别以色块和括号标记），AhHIR与大豆HIR1、玉米HIR1、小麦HIR1和HIR2、大麦HIR1聚为类型A；大豆HIR4、玉米HIR4等属于类型C，类型C的HIR基因与其他类型遗传距离较远。查询PFAM蛋白数据库，发现类型C的HIR蛋白除了在N端存在与其他类型相同的Band-7结构域，还在C端存在其他结构域。

2.5选择压力和氨基酸替代情况分析

选用6个物种共17条HIR基因序列通过比对重排，每一条序列含有912个碱基位点，304个氨基酸位点，用PAML分析时选用的模型参数参见表2，似然率检验结果参见表2。根据M0模型，所有位点与分支的平均ω=0.05997，说明HIR基因在进化中受强烈的纯化选择。在M8模

大豆（G. max），NM_001289276.1；GmaHIR3：大豆（G. max），JN083834.1；GmaHIR3like： 大豆（G. max），NM_001252931.2；GmaHIR4： 大豆（G. max），JN083833.1；GmaHIR4like：大豆（G. max），NM_001254549.1；CanHIR：辣椒（Capsicum annuum）AY529867.1。

图4不同物种HIR基因系统进化树及对应的蛋白结构型BEB分析结果中，针对所有氨基酸位点的ω值进行统计，在99%后验概率下，ω值≤0.1的为负选择位点，共存在202个，占总序列的69%；ω≤0.01的负选择位点有129个，占总数的44%。位点编号以HvuHIR1为标准（图5）。蛋白晶体模型预测结果表明，AhHIR与同样存在Band-7 domain的Stomatin蛋白三级结构（图6A）相同[20]。将以上位点数据通过SwissPDB-viewer导入AhHIR晶体模型中，结果显示这些受强烈纯化选择的氨基酸位点大多位于α螺旋和β折叠中（图6B、C），这部分氨基酸在维持蛋白结构中非常重要，而通道区域（图6B白色箭头标记）的保守性相对较低。

3讨论

HIR基因参与ETI途径的免疫应答[5，10～12，18]，在植物HR反应中行使重要的功能。本研究首次在花生中克隆了HIR基因，对花生HIR氨基酸序列分析表明其存在Band-7蛋白结构域，AhHIR蛋白可能与其他家族成员一样参与了细胞膜离子通道的控制[5]。通过qRT-PCR分析了该基因在受到生物胁迫和非生物胁迫时的表达情况，结果表明，两种逆境胁迫均使AhHIR表达短期下调。由于HIR的表达升高可能会导致更多的细胞死亡[11]，短期内的低温胁迫使HIR基因强烈下调有助于细胞死亡率降低，随着低温胁迫延续，HIR基因缓慢上调，这可使细胞死亡正常化，但其表达量并没有超出正常表达水平。HIR基因在逆境下的表达变化可能与细胞为适应环境改变而做出的一系列生理反应有关，如诱使内源激素合成信号的传导以及活性氧的积累[19]。

生物在进化中对环境的改变会做出一系列的适应性进化，例如核酸的突变和蛋白的变化，HIR基因在进化分析中表现为强烈的保守性，在99%后概率检验下，ω≤0.1的负选择位点有202个，占总数的69%，ω≤0.01的负选择位点有129个，占总数的44%，这说明HIR基因受到了强烈的纯化选择，可能是由于该基因的功能非常重要，该基因突变后植物难以存活。将这些高度保守位点导入Band-7 domain蛋白质三级结构模型发现，大多数受强烈纯化选择的位点都位于α螺旋和β折叠中，而在3个Band-7亚基形成的通道结构中的氨基酸位点保守性相对较低。

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