微透析和高效液相色谱法测定大鼠脑内天麻素及天麻苷元含量

吕允凤

·药学研究·

微透析和高效液相色谱法测定大鼠脑内天麻素及天麻苷元含量

吕允凤

目的 考察不同剂量天麻素皮下及口服给药后大鼠脑内的天麻素及其代谢产物天麻苷元的浓度变化。方法 采用脑内微透析技术进行在体动态取样，建立了高效液相-串联四级杆质谱方法测定脑透析液中的天麻素含量，建立了高效液相-二极管阵列检测方法测定脑透析液中的天麻苷元含量。结果 两种给药方式大鼠不同脑区内天麻素浓度均较低，天麻苷元脑内浓度明显高于其原型药物天麻素。结论 天麻素的血脑屏障透过能力差，但其活性代谢产物天麻苷元能够较好地进入脑内发挥作用。

天麻素；天麻苷元；高效液相-串联四级杆质谱；高效液相-二极管阵列检测；微透析

0 引言

天麻素(Gastrodin，GAS)是我国传统中药天麻的主要有效成分，近年来被用于改善学习记忆功能和治疗老年痴呆[1-2]。其代谢产物天麻苷元(Gastrodigenin，p-hydroxybenzyl alcohol，HBA)同样具备对神经的保护作用等活性[3]。脑是GAS的作用靶器官，有观点认为，其脑内作用是通过HBA实现的，而目前对GAS脑内主要存在形式及入脑情况的研究较少。本文采用微透析技术对给药后大鼠进行连续取样，测定皮下及口服给药后大鼠脑内不同脑区GAS和HBA浓度，对GAS及其代谢产物的入脑情况进行研究。

1 仪器与试药

大鼠脑定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、牙科直型手机(日本NSK公司)、THOMAS ISO 014牙科钻头(法国 BORGES公司)、B030802与B030503型微透析探针(绵阳高新区佰脉生物仪器有限公司)、Ⅱ型自凝造牙粉(上海珊瑚化工厂)、PHD2000型微量恒流泵及微量控制器(美国HARVARD公司)、Dulbecco′s磷酸缓冲盐(美国SIGMA公司)。

Waters2795型高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Quattro premier串联质谱仪(美国Waters公司)、Waters996型二极管阵列检测器(美国Waters公司)、symmetryShieldTMRP18色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm美国Waters公司)、Waters MassLynxTM 4.0工作站(美国Waters公司)。

麻醉用戊巴比妥钠(纯度99%，国药集团化学试剂有限公司，WS20070403)、GAS对照品(纯度99.8%，中国药品生物制品检定所，110807-200205)、HBA对照品(纯度99.4%，中国药品生物制品检定所，110896-200001)、甲酸(美国SIGMA公司)、甲酸胺(美国SIGMA公司)、甲醇(HPLC级，美国TEDIA公司)、乙腈(ABSOLVE级，美国TEDIA公司)。

实验动物：雄性Sprague-Dawley大鼠(北京实验动物中心维通利华公司提供)，250～300 g。实验动物生产许可证号：SYXK(京)2003-0008。

2 方法与结果

2.1 大鼠脑内微透析方法[4-6]Dulbecco′s灌流液的配制：取Dulbecco′s磷酸缓冲盐加水及CaCl2溶液配制成含138 mmol/L NaCl，8.1 mmol/L Na2HPO4，2.7 mmol/L KCl，1.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mmol/L MgCl2和1.2 mmol/L CaCl2，pH值7.4的缓冲溶液。

药物配制及给药分组：SD大鼠共48只，分为皮下给药组和灌胃给药组。皮下给药组分为3个剂量组，每组12只，分别为10 mg/kg组、30 mg/kg组、50 mg/kg组；灌胃组12只，为50 mg/kg剂量组。每只大鼠均进行中层额前皮质(mPFC)、伏核(NAC)和海马(HIP)脑区的手术。

大鼠手术操作：将大鼠麻醉后，分别在脑内mPFC、NAC及HIP脑区植入探针导管。以1.5 μL/min灌流速度进行取样，在收集1个空白样品(每次30 min)透析稳定后，以此点为零时间点，经皮下给药管或灌胃给予一定剂量的药物，于第30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min换收集管收集透析液。

2.2 脑透析液中GAS分析方法的建立[7]GAS储备液及标准液的配制：准确配制质量浓度为5 mg/mL的GAS对照品储备液。然后采用甲醇作为稀释液，将储备液稀释后，制成浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、500、1 000 μg/mL的GAS标准工作液。以唑吡坦配制250 ng/mL内标溶液备用。

2.2.1 色谱条件 美国Waters公司symmetryShieldTMRP18色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。选用含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的甲醇(B)系统作为流动相。采用梯度洗脱。起始比例为A∶B=97.5∶2.5，0 min开始，B相以变化曲线2的速率从2.5%上升到90%(0～2 min)，维持该比例8 min(2～10 min)，10 min起B相比例在1 min内回复到起始的2.5%，最后A∶B=97.5∶2.5水平维持4 min，整个分析时间为15 min，梯度流速恒定为0.2 mL/min，柱温为25 ℃，进样量20 μL。内标和GAS对照品的保留时间分别为4.72 min和4.37 min。

2.2.2 质谱条件 ESI+离子源；扫描范围m/z 100～1 000；毛细管电压3.0 kV；锥孔电压25 V；离子源温度105 ℃；脱溶剂气(N2)温度350 ℃；流速60 μL/min；碰撞气(Ar)流速0.25 mL/min；碰撞诱导电压(CID)分别为15 V(GTD)、20 V(LZH)和20 V(IS)。MRM检测：m/z 303.9→m/z 106.7(GTD)、m/z 136.8→m/z 54.9(LZH)和m/z 308.2→m/z 235.0(IS)。

2.2.3 方法的专属性考察 将内标色谱图(图1A)、GAS色谱图(图1B)及空白脑透析液色谱图(图1C)进行比较。由图可见，基线噪音较小，药物及内标峰形良好，无杂质峰干扰。说明本方法具有较高的专属性。

图1 色谱图

2.2.4 线性关系考察 配制浓度为0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的标准溶液。以样品与内标的峰面积之比(R)和样品的浓度(C)做线性回归得到标准曲线，权重系数为1/X，线性范围为0.05～1 000 ng/mL，回归方程为Y=0.050 6X+0.169 8，r=0.999 8。检测限和定量限分别以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1计。在脑透析液中，定量下限低于0.05 ng/mL，最低检测限和定量限分别约为0.028 ng/mL和0.040 ng/mL。

2.2.5 回收率与精密度 配制3个浓度分别为500.0、10.00、0.100 0 ng/mL的质控样品(QC)溶液各5份，考察日内精密度、日间精密度并计算相对回收率。各质控日内日间精密度RSD均小于4%，相对回收率(%)分别为(99.7±2.1)、(101.4±2.7)和(101.2±1.6)。

稳定性考察：GAS透析液样品在4 ℃环境下至少能稳定放置24 h，GAS透析液样品在-70 ℃冰冻环境下至少能稳定放置12周，反复冻融3次后仍保持稳定。体外增量法测得两种型号微透析探针对GAS的回收率分别为19.97%和23.06%。

2.3 脑透析液中HBA测定方法的建立 HBA标准溶液配制：准确配制质量浓度为5 mg/mL的HBA对照品储备液。用超纯水将储备液稀释后，制成浓度为50、100、500、1 000、5 000、10 000 ng/mL的HBA标准工作液。

2.3.1 色谱条件 使用美国Waters公司symmetryShieldTMRP18色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。选用了含0.05%甲酸和2 mM甲酸胺的水(A)-乙腈(B)系统作为流动相。检测波长为220 nm。采用梯度洗脱过程。起始比例为A∶B=90∶10，0 min开始，B相以匀速从10%上升到73%(0～2 min)，维持该比例7 min(2～9 min)，9 min起B相比例在1 min内回复到起始的10%，最后A∶B=90∶10水平维持5 min，整个分析时间为15 min，梯度流速恒定为0.22 mL/min，柱温为25 ℃，取脑透析液样品20 μL，加入20 μL超纯水，混匀，进样量20 μL。HBA对照品的保留时间为6.61 min。

2.3.2 方法的专属性 将HBA对照品液加入空白脑透析液中的色谱图(图2A)与空白脑透析液色谱图(图2B)进行比较。可见基线噪音较小，HBA峰形良好，无杂质峰干扰。说明本方法具有较高的专属性。

图2 色谱图

2.3.3 线性关系考察 配制浓度为5.0、10、50、100、500、1 000 ng/mL的标准溶液测定。以样品峰面积和样品的浓度做线性回归得到标准曲线，权重系数为1/X，线性范围为5～1 000 ng/mL，回归方程Y=167.3X-859.4，r=0.999 8。

2.3.4 检测限和定量限 分别以信噪比S/n=3∶1和S/n=10∶1计。在脑透析液中，最低检测限和定量限分别约为0.310 ng/mL和1.030 ng/mL。

2.3.5 回收率与精密度 配制5.0、50、500 ng/mL3个浓度的HBA质控样品，考察HBA回收率与精密度。各质控日内日间精密度RSD%均小于2%，相对回收率(%)分别为(100.4±1.4)、(99.9±1.3)和(100.7±1.2)。

2.3.6 稳定性考察 HBA透析液样品在4 ℃环境下至少能稳定放置24 h，HBA透析液样品在-70 ℃冰冻环境下至少能稳定放置12周，反复冻融3次后仍保持稳定。体外增量法测得两种型号探针对HBA的回收率分别为18.76%和23.31%。

2.4 实验结果 皮下给药后不同脑区内(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA药时曲线的比较见图3。

图3 大鼠皮下给予GAS 10、30、50 mg/kg后，各脑区GAS和HBA的浓度-时间(C-T)曲线图

口服给药50 mg/kg GAS后，不同脑区内(mPFC、NAC、HIP)GAS和HBA药时曲线的比较见图4。

图4 大鼠口服给予50 mg/kg GAS后，各脑区GAS和HBA的浓度-时间(C-T)曲线图

由结果可见，GAS皮下给药后，脑内药物浓度呈剂量相关性，但总体脑内浓度很低，给药1～2 h内达最高浓度，3个脑区内的药物分布不存在显著差异。口服给药后，透过血脑屏障的药物量略高于皮下给药。各脑区药物分布无显著差异，脑内药物峰浓度平均值与体内药动学试验中体内药物峰浓度相比，占体内药物浓度的比例低于0.2%。可见，GAS的血脑屏障透过率极低。GAS皮下给药后，脑内HBA浓度与给药量呈剂量相关性，给药90 min内达最高浓度，3个脑区内的药物分布不存在显著差异。灌胃给药后，大鼠脑内HBA于给药后90 min达峰，各脑区分布NAC中较mPFC与NAC中略低但差异不大。无论皮下给药还是灌胃给药，脑内HBA浓度均显著高于GAS浓度水平(P<0.001)。

3 讨论

本文建立了灵敏准确的GAS和HBA定量检测方法，配合微透析取样技术对大鼠不同脑区的原型药物GAS及其主要活性代谢产物HBA进行了连续检测。

大鼠皮下给予GAS后，30 min高剂量组能够检出GAS，而低剂量组几乎检测不到GAS的存在，1～2 h内脑内各脑区的GAS都达到最高浓度，各剂量组脑中药物浓度亦呈剂量相关性，但各脑区内含量都很低，各脑区之间无显著差异。灌胃给药后，GAS在各脑区内于1.5 h达峰，峰浓度略高于皮下给药，但仍然低于100 ng/mL。灌胃给药GAS血中的达峰时在0.5 h以内，可见脑内达峰时滞后较长时间。脑内峰浓度与同剂量血中峰浓度相比，低于0.2%。说明GAS虽然能够透过血脑屏障，但透过率很低。

建立了HBA的脑内透析液中的测定方法，结果发现，给予GAS后，脑内HBA的含量是GAS含量的6～10倍。皮下给药时，30 min各剂量组都能测得HBA的存在，1.5 h脑内HBA达峰，各脑区之间差异无统计学意义，这与皮下给药后脑内DA和ACh的升高峰值时间相符合，说明GAS给药后产生的脑内神经递质调节作用可能与其代谢产物HBA入脑及其活性有关。

灌胃给予GAS后，脑内HBA在各脑区的分布均匀，达峰时约为1.5 h，同样滞后于血中药物达峰时，可能是由体内代谢过程和透过血脑屏障的过程造成其达峰时的滞后。

微透析技术在脑内药物浓度研究过程中具有连续取样动态监测的优势，但限于其取样量低、探针回收率低等缺点，导致其测得的药物浓度绝对量可能存在误差。因此，本文仅针对数据的相对变化趋势及相对量进行比较。另外，由于微透析取样为阶段取样(30 min)，因此，各时间点药物浓度反映的实际为此时间点之前30 min内的平均浓度[8]。

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Microdialysis and HPLC method for the determination of gastrodin and gastrodigenin in rat brain

LÜ Yun-feng

(Center for Medical Device Evaluation,SFDA,Beijing 100044,China)

Objective To detect the level of gastrodin and its metabolites gastrodigenin in rat brain dialysate after subcutaneous or oral administration of different doses of gastrodin.Methods Gastrodin in rat brain dialysate was determined by HPLC-MS/MS method and gastrodigenin was determined by HPLC-diode array detector method.Results The gastrodin levels in different rat brain regions for both subcutaneous and oral administration were low while the concentration of gastrodigenin in rat brain was significantly higher than gastrodin.Conclusion The results show that gastrodin could hardly pass through the blood-brain barrier,but its active metabolites gastrodigenin has a greater ability to penetrate the blood-brain barrier and play a role in brain.

Gastrodin;Gastrodigenin;LC-MS/MS;HPLC-diode array detector;Microdialysis

2013-06-03

国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京 100044