大亚湾浮游植物DNA指纹及其与群落结构的关系

熊毅俊,王朝晖,王 剑 (暨南大学生态学系,水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室,广东 广州 510632)

浮游植物是海洋生态系统的重要组成成分与初级生产者,是鱼类和其他经济动物的直接或间接的饵料[1].传统浮游植物的分类鉴定,主要借助显微镜观察,但该技术需要依靠研究者丰富的鉴定经验,并且许多微小浮游植物在显微镜下难以区分,很容易出现错误判断[2].随着分子生物技术的迅速发展,分子生物学方法已被广泛应用于海洋浮游植物研究[3].

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是根据在不同浓度的变性剂中DNA片段解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同而碱基组成不同的片段分开[4].国外对DGGE技术的应用已日趋成熟,目前研究主要集中在环境微生物群落结构多样性分析上,包括物种组成分析,群落相似度比较以及分子进化树分析等[5-6].DGGE技术在浮游植物群落结构分析上的运用较少,Wang等[7]采用甲藻的特定引物成功分析鉴定了18种实验室培养甲藻株系;邵娟等[8]利用DGGE技术对常见海洋赤潮藻类及赤潮水样进行了分析,发现DGGE结果与显微镜观察结果具有较好的一致性;同时DGGE技术也能较好地反映淡水湖泊浮游生物群落[9].此外,利用DGGE技术还可以鉴定某些在光学显微镜下难以区分的超微型浮游生物[10].

大亚湾位于南海北部,是广东省重要的养殖基地,也是大亚湾核电站和惠州港所在地.由于近些年该海域污染日趋严重,营养盐状况发生明显变化,导致该海域的浮游植物群落结构发生显著变化[11].鉴于先前对大亚湾浮游植物群落结构的研究主要集中于传统方法的观察研究,对于分子水平上的研究较为有限,仅本课题组于2011年对大亚湾浮游植物 DNA指纹进行了初步分析[12].为了进一步了解DGGE技术在浮游植物多样性研究中的应用,揭示大亚湾海域浮游植物 DNA指纹,本文采集了大亚湾海域表层水样,对大亚湾浮游植物进行了显微镜定性定量分析,并利用PCR-DGGE技术对浮游植物的 DNA指纹进行了研究,以揭示DGGE技术等分子手段在浮游植物群落结构多样性分析上的应用.

1 材料与方法

1.1 采样点的设置和样品的采集分析

图1 大亚湾采样点的设置Fig.1 Sampling stations in Daya Bay

在大亚湾海域设置了 9个采样点(图 1),于2012年5月和6月采集表层水样4L,用1.5%的鲁格氏液固定.样品经静置沉降及浓缩后,用1.2μm孔径的滤膜(Millipore)抽滤,滤膜于-20°保存待分析.另外采集表层水样1L,用4%的福尔马林固定,经浓缩后在显微镜下对浮游植物进行定性定量观察.

1.2 浮游植物总DNA的提取

将滤膜冰浴剪碎,置于 1.5mL离心管中,用UNIQ柱式植物基因组提取试剂盒(上海生工)提取总 DNA,用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果后,保存于4℃备用.

1.3 PCR扩增

PCR扩增区域为18S rDNA V3区,用真核生物 V3区通用引物 F1427GC(5′-CGCCCGCCCG CGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC CTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG-3')和R1616(5'-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3')[13]对提取的浮游植物总 DNA 进行扩增,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.

PCR反应在Applied Biosystems verityTMPCR仪中进行,反应体系为 30μL,包括3μL 10×反应缓冲液、0.8μL 上、下游引物(10μmol/L)、0.8μL dNTPs(10mmol/L)、0.5μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、模板量1.5μL,最后以ddH2O补足体积.PCR反应条件为94℃ 1min,94℃变性1min,65℃退火1min(每个循环降低1℃),72℃延伸1min,10个循环;94℃变性1min,55℃退火 1min,72℃延伸1min,20个循环;最后72℃延伸10min.用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,扩增出来的目的片段大小为 210bp,大小均一,适于DGGE电泳扩增范围(200～600bp).

1.4 DGGE分析

取 PCR 产物 30μL,在 Bio-Rad公司的DcodeTM通用突变检测系统对 PCR产物进行DGGE分析.DGGE条件为:丙烯酰胺质量分数8%,变性梯度 30%～70%(100%的变性剂浓度为7mol/L尿素和质量分数 40%去离子甲酰胺),先用200V电压电泳10min,然后再用 100V电压电泳 16h,缓冲液为 1×TAE,电泳结束后用 SYBR GREEN I染色20min,用 Bio-Rad公司凝胶成像系统(GelDoc2000TM)进行拍照.

1.5 数据分析

DNA指纹图谱用Quantity one软件分析,其中各站点的条带光密度值强度低于 0.05将被排除,对各站点的条带进行标记并进行相似度分析,以Pearson系数0.5作为聚类临界点,最后采用非加权组平均法(UPGMA)对图谱进行聚类分析[14].

显微镜观察结果用Spss19软件进行聚类分析,为了减少不同浮游植物物种数量的差异,对浮游植物细胞密度进行了自然对数转换.采用组间联接的聚类方法,平方Euclidean距离的度量方法对9个不同站点进行聚类.

2 结果

2.1 DNA指纹图谱

图2 大亚湾表层浮游植物18S rDNA V3区DGGE图谱Fig.2 DGGE fingerprints of 18S rDNA V3 region of phytoplankton in surface layer of Daya Bay

图3 浮游植物18S rDNA V3区DGGE图谱分析带型图Fig.3 DGGE profile analysis of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

将PCR扩增产物进行DGGE电泳,DGGE电泳图谱显示各站点浮游植物的DNA指纹(图2).较亮的条带为优势种,而同一水平位置的条带则代表同一物种.结果显示,浮游植物DGGE图谱条带清晰,各站点之间优势种既有交叉又有所差异.用Quantity one软件分析得到的DGGE带型图能更清楚显示出DNA指纹图谱(图3),5月份浮游植物DGGE图谱中共有26条不同条带,各站点条带数为5～17条,S3站点条带最多,S5和S2站点较少(图3a).其中条带9在所有站点中均出现,条带7、8、11在8个站点中出现,而条带2、3、10、13也是常见优势条带.6月份浮游植物DGGE电泳图谱共发现 28条带,每个站点条带数为 7～24条(图3b),其中S2站点最多,S5站点最少.与5月份相比,6月份优势条带更为丰富,条带数更多.而其中S2站点变化最大,条带数由5月份的5条增加至6月份的24条.

2.2 浮游植物群落结构

硅藻是大亚湾浮游植物的主要类群,其次为甲藻(图4),还存在少量绿藻和蓝细菌.5月份和6月份9个站点硅藻分别占浮游植物总数29.0%～99.4%和 7.9%～99.9%,平均分别为 85.0%和77.1%.5月份和6月份浮游植物平均细胞密度相差不大,分别为3.84×105cells/L 和 6.05×105cells/L.5月份细胞丰度最高的是 S1,为 1.08×106cells/L;S7浮游植物密度较低,为1.17×104cells/L.6月份细胞密度最高的是 S3,为2.06×106cells/L;S5细胞密度最低,为9.7×104cells/L.优势种硅藻包括环纹娄氏藻(Lauderia annulata)、丹麦细柱藻(Leptocylindrus danicus)、拟菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.)、菱形海线藻(Thalassionema nitzschioides)、冰河拟星杆藻(Asterionellopsisglacialis)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、细弱海链藻(Thalassionema subtilis)、角毛藻(Chaetoceros spp.)、小环藻(Cyclotella spp.)等.优势甲藻主要为小型裸甲藻属(Gymnodinium spp.)和反曲原甲藻(prorocentrum sigmoides).

5月份反曲原甲藻在S5大量出现,在甲藻和浮游植物中的百分比含量分别为92.2%和65.5%.6月份裸甲藻在S3、S7中大量出现,该藻在甲藻和浮游植物中的百分比含量分别为 99.4%和91.6%以及99.1%和47.2%.2种甲藻的大量出现导致了甲藻在这些站点的百分比含量明显高于其他站点,而且在5月份S5以及6月份S3中甲藻的百分比含量均超过了50%.此外,在6月份S8的浮游植物组成与其他站点也具有明显差别,主要表现在其他藻类百分比的上升,这主要是由于在该样品中,蓝细菌中的色球藻(Chroococcus spp.)的大量出现,导致了以该藻为主的其他藻类百分比上升为59.9%.

图4 各站点不同类别浮游植物的数量百分比Fig.4 Quantitative percentages of different groups of phytoplankton in each station

2.3 浮游植物种类与DNA指纹条带的比较

图5可以明显看出,显微观察分析得到的浮游植物种类数明显高于DGGE条带数.在5月份和6月份的2次调查中,共分析鉴定出浮游植物72种,其中5月份为52种,每个站点鉴定的种类数为 12～26种;6月份共分析鉴定出浮游植物 54种,每个站点鉴定的种类数为12～30种.

图5 浮游植物显微观察种类数及DGGE指纹条带数的比较Fig.5 Comparison between species number and DGGE fingerprint bands of phytoplankton

为了避免DGGE分析中浮游植物优势种类对稀有种类的屏蔽作用,将百分比含量小于0.1%的种类进行剔除,再与 DNA指纹条带数进行比较.结果显示,种类数与 DNA指纹条带数变化规律基本一致(图 5),说明 DGGE分析能在一定程度上反映浮游植物的种类多样性.5月份优势种的种类数都高于DNA指纹条带数,这是由于5月份样品中各站点细胞密度最高的优势种均为拟菱形藻(Pseudo-nitzschia spp.),它们的百分比含量均超过 80%,而其他所有非优势种的百分比较低.因此 DNA 扩增过程中,拟菱形藻很有可能对其他密度较低的非优势种存在屏蔽效应.而6月份优势种类数则与DNA条带数相近甚至低于条带数.一方面是由于6月份浮游植物均匀度较高,优势种相对含量较少,而种类较为丰富,优势种类产生的屏蔽作用也较小;另一方面可能由于显微观察较难区分形态结构类近的同属种类,而在DNA指纹图谱中却能将同属不同种类的浮游植物分离.

2.4 浮游植物群落以及DNA指纹聚类分析

图6 根据浮游植物DGGE指纹图谱的聚类分析图Fig.6 Clustering dendrogram of sampling station based on DGGE fingerprints of phytoplankton

从DGGE指纹图谱得到的聚类分析结果与各站点的地理位置具有一定关系(图1,图6).近岸海域的站点如S2、S3、S6之间相似度高,聚为一类;而远岸海域如 S1、S4、S5、S7、S8、S9聚在一起(图 6a)或者单独为一类(图 6b).说明浮游植物 DNA植物具有一定的空间分布规律.而通过浮游植物群落进行聚类分析结果与DGGE指纹聚类结果相近(图7),澳头近岸海域的S2和S3总是聚在一起,其余较为远岸站点聚成一大类.

图7 根据浮游植物群落丰度和种类数的聚类分析Fig.7 Clustering dendrogam of sampling stations based on cell abundance and species richness of phytoplankton community

3 讨论

大亚湾夏季浮游植物种类丰富,共分析鉴定出浮游植物 72种;DNA指纹条带也比较丰富,2个月份分别得到 26和 28条不同条带.一般来说,DNA指纹条带数要远远低于浮游植物种类数,但是剔除非优势种后,DNA条带数与种类数变化趋势相近(图5).结果说明DNA指纹图谱能较大程度地反映浮游植物优势种群的组成,而对于相对含量较少的物种,可能会由于优势种的屏蔽作用而被掩盖.作为一种分子手段, DGGE技术能够快速、准确地分析群落结构多样性,弥补显微观察中一些难以区分的种类以及微小物种的分离鉴定[10].在本研究中,6月份的某些样品中DNA指纹数要高于优势种类数,说明对某些相对含量＞0.1%的优势物种,DGGE技术对浮游植物物种的区分度要比显微镜分析更为精确.另一方面,由于DGGE技术本身所存在的缺陷,电泳过程中容易发生共迁移现象[15-16],造成碱基组成相近的DNA片段区分困难,一条DNA条带中有时可能存在几个相近物种的 DNA指纹;此外,对于较少的非优势种,由于DNA含量极少,在后续的PCR扩增中,会被数量较高种类的 DNA所掩盖,导致其无法在DGGE图谱中出现.针对出现的这些技术缺陷,目前的解决方法是将条带切胶回收测序,通过是否可获得单一的序列来判断条带携带的遗传信息.由此说明 PCR-DGGE技术在分析浮游植物群落结构上具有一定的可行性.

通过聚类分析发现,显微镜观察的聚类结果与 DNA指纹的聚类分析结果较为一致,能较为清楚地将富营养化严重的近岸海域和较为清洁的远岸海域区分开来(图6).由于生活污水排放以及大规模的养殖,南澳以及大鹏澳近岸海域富营养化严重,营养盐含量高[17].本研究结果显示,靠近养殖区的站点S2、S3、S6浮游植物生物量丰富,甲藻数量明显增多,说明富营养化已经对浮游植物群落结构产生严重影响.远岸海域的几个站位虽然所处的海域不同,离岸远近也有些差异,但是没有处于富营养化严重的养殖区域,这几个站位的浮游植物群落结构和 DNA指纹均相近,在聚类分析中也聚为一大类.本研究结果说明,营养化程度是影响大亚湾海域浮游植物分布的重要原因.此外,位于核电站附近的 S5站点浮游植物种类、数量以及DNA指纹条带数均较低,核电站温排水可能也是影响浮游植物群落结构的重要因素,特别是在夏季高温季节[18].

此外,6月份S8样品中发现有大量的蓝细菌,细胞密度达到 1.28×105cells/L,约占细胞总密度的60%.蓝细菌是地球的先锋生物,具有抗高温、抗紫外以及抗摄食能力[19],随着水温、紫外辐射的增加以及富营养化的加剧,蓝细菌水华已经成为全球水环境的巨大挑战[20].大亚湾海域也已出现蓝细菌数量上升趋势[18],而在本研究中出现的大量蓝细菌更进一步说明了大亚湾海域浮游植物群落结构有向蓝细菌演变的趋势.但是在DNA指纹图谱研究中,由于PCR扩增中使用的引物为真核生物通用引物,未能将蓝细菌 DNA扩增出来.因此,在以后的 DNA指纹图谱研究中需要设计蓝细菌的特异性引物进行PCR扩增,从而更全面了解浮游植物的DNA指纹和分子多样性.

4 结论

4.1 DGGE技术能较好地反映浮游植物优势种群多样性,在显微观察中,一些难以区分的种类以及微小物种的分离鉴定都可以通过DGGE技术得到解决,但是对于一些相对含量较少的种类,其遗传信息可能会被优势种类所屏蔽.

4.2 近海岸富营养化对大亚湾海域浮游植物群落结构影响较大,浮游植物种类和细胞密度相对其他海域较高,而在靠近核电站的附近海域中,核电站温排水对浮游植物群落结构具有一定影响.

4.3 大亚湾海域某些站点出现了大量的蓝细菌和裸甲藻,存在引发赤潮的风险,在今后的DNA指纹分析中需要对原核微型浮游植物进行研究.

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