同位素稀释－气相色谱－质谱法检测大鼠血浆中的内源性胍丁胺

丘忠丽， 林 缨， 熊志立， 谢剑炜＊

（1.抗毒药物与毒理学国家重点实验室，军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳110016）

胍丁胺（agmatine，Agm）是精氨酸在细胞线粒 体膜上左旋精氨酸脱羧酶（L－arginine decarboxy－lase，L－ADC）催化作用下的脱羧产物。1994年Li等［1］首次从哺乳动物体内成功分离检测到胍丁胺。内源性胍丁胺及其相应受体可能在中枢神经系统内构成了阿片功能的调节系统［2］。外源性胍丁胺具有增强吗啡镇痛、降低其成瘾性和抗耐受作用［3］以及明显的抗抑郁、抗焦虑作用［4］，能够抑制阿片依赖和复吸［5］，而内源性胍丁胺在阿片依赖发生发展中的作用尚属未知。内源性胍丁胺的高灵敏度、高特异性分析方法的建立，对于监测内源性胍丁胺在生物体内的变化，进而阐明内／外源性胍丁胺作为候选神经递质的基本生物学特征以及在阿片依赖和复吸发生发展中的作用具有重要意义。

胍丁胺无紫外和荧光吸收，极性大，自身难以气化，因此在常规的气相色谱、液相色谱及其联用质谱上均难以直接检测，现有的检测方法主要通过衍生化反应来实现。目前文献报道的检测方法主要有高效 液 相 色 谱 法 （HPLC）［6－11］、气 相 色 谱 法（GC）［12－14］、毛细管电泳法［15，16］和酶联免疫吸附法（ELISA）［17］等。其中，HPLC 常用衍生化试剂如邻苯二 甲 醛－β－巯 基 乙 醇 （OPA－ME）［6，7］、萘 二 甲 醛（NDA）［8］等衍生化后，采用荧光［6－8，10］或质谱［11］检测器检测，但由于衍生化后造成基底干扰严重，不适用于复杂基质中胍丁胺的高灵敏检测。GC和GCMS是较常用的检测方法。Kawabata等［12］对比了不同的衍生化试剂包括乙酰丙酮（AA）、三氟乙酰丙酮（TFAA）以及六氟乙酰丙酮（HFAA）的衍生化效果，结果发现，乙酰丙酮类化合物能够与胍类进行特异性的衍生化反应，胍丁胺与HFAA衍生化反应的产率最高，产物挥发度高，且稳定性最好，是采用GC或GC－MS检测胍丁胺的最佳衍生化试剂（胍丁胺、HFAA及其衍生化产物的推测结构式见图1）。因此，目前基于GC技术分离检测胍丁胺的方法均采用HFAA衍生化，通过与质谱检测器联用能够获得较高的检测灵敏度。

由于稳定性同位素与被测组分化学结构相同，仅个别元素是质量不同的同位素，因此二者的理化性质非常接近，能充分发挥内标在样品预处理及色谱行为中的校正作用。稳定同位素已成为质谱检测器检测时的理想内标。刘潇等［18］测定人血清中的多溴联苯，刘芷彤等［19］分析环境样品中的多氯萘，均使用了同位素内标。王海龙等［20］以d8－胍丁胺为内标，采用液相色谱－电喷雾离子阱质谱直接检测大鼠尿中的胍丁胺原型及乙酰化代谢产物，该方法不需衍生化，操作流程简单，但未见有效的方法学数据。Chen等［14］以15N4－胍丁胺为内标，HFAA 衍生化后采用GC－NCI／MS检测。该方法检出限低达0.01 ng／g（湿重）（计算值），但是需经过两次液液萃取，样品前处理较为繁琐。

图1 胍丁胺（Agm）、内标（d8－Agm）、胍丁胺与六氟乙酰丙酮（HFAA）衍生化预测产物的结构式［15，16］Fig.1 Structures of agmatine（Agm），internal standard d8－Agm and the predicted derivatives of Agm with hexafluoroacetone（HFAA）

本文建立了大鼠血浆中内源性胍丁胺的GCNCI／MS分析方法。以稳定同位素标记的d8－胍丁胺为内标，大鼠血浆样品经蛋白沉淀后直接采用HFAA衍生化，Florisil固相萃取柱净化，选择离子模式监测。所建立的方法简便快捷、特异性好、灵敏度高，能够应用于大鼠血浆中内／外源性胍丁胺生理功能的研究。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

气相色谱－质谱联用仪（Agilent 6890N GC－Agilent 5975MSD，Agilent公司，美国），配备化学电离源（CI）、自动进样器及数据处理工作站；固相萃取装置（Waters公司，美国）；固相萃取小柱（Alltech公司，美国）；2 mL顶空瓶、顶空瓶手动封盖器（Gerstel公司，德国）；弗罗里硅土（Florisil）填料（Alltech公司，美国）。

HFAA（纯度≥98%，Sigma公司，美国）；胍丁胺硫酸盐（纯度≥99.9%）、d8－胍丁胺硫酸盐（纯度≥95%）均由军事医学科学院毒物药物研究所药物合成实验室提供。甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯（色谱纯，Duksan Pure Chemicals公司，韩国）；实验用水均经超纯水系统处理；分析纯醋酸铵购于国药集团北京化学试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GC－MS条件

GC条件：色谱柱为HP－5MS毛细管柱（25 m×0.20 mm×0.33μm，Agilent公司，美国）；载气为氦气，恒流模式，流速为1 mL／min；进样口温度为260℃；传输线温度为280℃；色谱柱升温程序：起始温度80℃，保持1 min，以20℃／min升至280℃，保持1 min；进样体积为1μL，不分流进样，保持0.3 min。

MS条件：离子源为CI，负离子模式检测；离子源温度为150℃；反应气为甲烷；溶剂延迟时间为7 min；监测离子为m／z 492（胍丁胺衍生物的分子离子峰）和m／z 500（d8－胍丁胺衍生物的分子离子峰）。

1.2.2 胍丁胺标准储备液和工作溶液的配制

精密称取胍丁胺硫酸盐10.0 mg，用超纯水配制成1.00 mg／mL的储备液；再将储备液用超纯水稀释至20μg／mL后，用50 mmol／L醋酸铵甲醇溶液逐级稀释成285、57.0、28.5、11.4、2.85、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的系列标准工作溶液。

1.2.3 内标d8－胍丁胺的配制

精密称取d8－胍丁胺硫酸盐17.2 mg，用D2O定容配制成1.72 mg／mL的内标储备液，再将储备液用乙腈稀释为50 ng／mL的工作液。

1.2.4 质控样品溶液的配制

将胍丁胺储备液逐级稀释成42.8、28.5、2.85 ng／mL的标准质控溶液，分别取50μL，加入50 ng／mL的内标溶液25μL，氮吹挥干后，依次加入大鼠血浆100μL即得。

1.2.5 血浆样品前处理

取100μL大鼠血浆，加入100μL甲醇，超声5 min，涡旋混匀后再加入800μL乙腈，超声5 min，涡旋混匀，于14 000 r／min下离心15 min。转移上清液至2 mL钳口瓶中，于45℃下蒸干，待衍生化反应。

1.2.6 衍生化过程

将钳口瓶置于冰上，准确加入50μL HFAA和50μL乙腈，用封盖器封盖，超声5 min，混匀，于100℃条件下反应90 min。反应后将其冷却至室温，于45℃条件下用氮气吹干，用200μL乙酸乙酯复溶。

1.2.7 衍生化产物的净化

将填装有500 mg Florisil填料的3 mL固相萃取柱置于固相萃取仪上，依次用2 mL二氯甲烷清洗、2 mL正己烷活化，将200μL乙酸乙酯复溶液上样于固相萃取柱，静置10 min，抽干。用500μL正己烷润洗钳口瓶后二次上样，静置10 min，抽干。用2.5 mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，彻底抽干。洗脱液于45℃条件下蒸干后，用100μL二氯甲烷复溶，取1μL进样。

2 结果

2.1 方法专属性

胍丁胺及内标d8－胍丁胺标准品衍生物在全扫描模式下的典型质谱图如图2所示。添加内标的空白溶剂及大鼠血浆样品中胍丁胺衍生物的选择离子监测色谱图如图3所示。由此可知，在本实验所采用的色谱条件下，胍丁胺和内标衍生物的保留时间分别为8.08、8.06 min；胍丁胺衍生物的峰形良好，无内源性杂质峰或衍生化副产物干扰。同位素内标中不含胍丁胺（氘代率接近100%），本方法具有良好的专属性。

图2 （a）胍丁胺和（b）d8－胍丁胺标准品衍生物在SCAN模式下的典型质谱图Fig.2 MS spectra of（a）agmatine and（b）d8－agmatine standard derivatives in SCAN mode

2.2 胍丁胺标准品溶液的线性范围和检出限

在 质 量 浓 度 分 别 为 285、57.0、11.4、1.14、0.570、0.285、0.114、0.057 ng／mL的100μL标准溶液中分别加入50 ng／mL的内标溶液50μL，挥干并衍生化后测定，以胍丁胺的质量浓度x（ng／mL）为横坐标，胍丁胺衍生物和内标衍生物的峰面积比值y为纵坐标绘制工作曲线，得到胍丁胺的回归方程为y＝0.015 2x－0.018 9，r＝0.998，线性范围为0.057～285 ng／mL。检出限（LOD）为0.005 7 ng／mL（S／N＞3）。

图3 添加内标d8－Agm的（a）空白溶剂和（b）大鼠血浆样品衍生物的SIM色谱图Fig.3 SIM chromatograms of the derivatives of（a）d8－Agm spiked in blank solvent and（b）Agm and d8－Agm spiked in rat plasma

2.3 血浆加标样品的线性范围

在质量浓度为57.0、28.5、11.4、5.70、2.85、1.14 ng／mL的100μL标准溶液中分别加入50 ng／mL的内标溶液25μL，挥干后，加入100μL大鼠血浆，涡旋混匀，沉淀蛋白并衍生化后测定。以胍丁胺的加标质量浓度x（ng／mL）为横坐标，将胍丁胺衍生物和内标衍生物的峰面积比值扣除空白血浆中胍丁胺衍生物和内标衍生物的峰面积比值，并将该值y作为纵坐标绘制工作曲线，得到胍丁胺的回归方程为y＝0.014 0 x－0.066 5，r＝0.997，线性范围为1.14～57.5 ng／mL。

2.4 血浆样品测定的精密度

配制质量浓度为2.85、28.5、42.8 ng／mL的胍丁胺质控样品，衍生化并测定。每一浓度进行6份样本分析，连续测定3日，计算本方法的精密度，结果见表1。结果显示，3个浓度的质控样品的日内相对标准偏差和日间相对标准偏差均小于15%，符合生物样品定量检测的要求。

表1 大鼠血浆中胍丁胺测定方法的日内、日间精密度Table 1 Precisions（intra－day and inter－day RSDs）of the method for the determination of agmatine in rat plasma

2.5 血浆样品的稳定性

将低、中、高3个加标浓度的血浆样品处理后于4℃下放置24 h、室温下放置4 h以及血浆样品于－20℃冻融循环3次，考察稳定性。结果如表2所示，在上述条件下放置不影响胍丁胺在血浆中的稳定性。另外，由于复溶溶剂是二氯甲烷，具有易挥发性，因此短期内不进行分析的样品应放入4℃冰箱内保存。

表2 不同条件下血浆样品的稳定性（n＝3）Table 2 Stability of rat plasma sample under different storage conditions（n＝3）

2.6 血浆样品中的回收率和基质效应

将血浆样品进行蛋白沉淀处理后分别添加低、中、高3个浓度的胍丁胺标准溶液，衍生化并检测。每一浓度进行6个样本的分析。与质控样品比较，计算胍丁胺在血浆中的回收率。同时将空白血浆基质配制质控样品的测定响应值与同浓度的标准溶液响应值相比较，计算基质效应。结果见表3，可见3个添加浓度下胍丁胺的回收率介于92.3%与108.8%之间，生物样品的基质效应在72.1%～92.7%范围内。

表3 血浆中胍丁胺的加标回收率及基质效应（n＝6）Table 3 Recoveries and matrix effects of agmatine spiked in rat plasma（n＝6）

2.7 实际生物样品检测

取SD大鼠10只（雌、雄各5只），眼眶取血；全血置于肝素化离心管中，于3 000 r／min下离心10 min得血浆。按所建立的方法处理血浆样品，衍生化后进样测定，计算得出血浆中内源性胍丁胺的平均质量浓度为（22±9）ng／mL；另外，雌、雄大鼠血浆中胍丁胺含量水平无显著性差异（p＞0.05）。

3 讨论

在HFAA衍生化过程中，用吡啶作为催化剂时衍生化产率较高，但副产物较多，且对毛细管柱损害较大。我们在此基础上进行优化，采用乙腈作为反应溶剂，并优化衍生化条件，采用固相萃取方法净化产物，结果得到较大的改善。

胍丁胺与HFAA衍生化反应后，衍生产物与胍丁胺相比降低了气化温度，使其可以在气相色谱上达到良好的分离检测，同时反应后产物成环，增加了产物的稳定性。负离子化学电离源属于软电离，对含电负性基团的化合物具有高选择性和高灵敏度。胍丁胺与HFAA的衍生化产物的化学结构中有12个强电负性的氟原子，因此采用气相色谱－负化学电离质谱可实现对产物的高灵敏度检测。

4 结论

本文以稳定同位素标记的d8－胍丁胺为内标，建立了大鼠血浆中内源性胍丁胺的同位素稀释－气相色谱－负离子化学电离质谱分析方法。HFAA衍生化后的胍丁胺血浆样品经Florisil固相萃取柱可得到有效净化。方法简便快速、特异性好、灵敏度高，已应用于大鼠血浆中内源性胍丁胺的定量检测。

［1］ Li G，Regunathan S，Barrow C J，et al.Science，1994，263（5149）：966

［2］ Su R B，Li J，Gao K，et al.Acta Pharmacol Sin（苏瑞斌，李锦，高凯，等.中国药理学报），2000，21（11）：1011

［3］ Su R B，Li J，Qin B Y.Acta Pharmacol Sin（苏瑞斌，李锦，秦伯益.中国药理学报），2003，24（7）：631

［4］ Uzbay T I.Neurosci Biobehav Rev，2012，36（1）：502

［5］ Su R B，Ren Y H，Liu Y，et al.Eur J Pharmacol，2008，593：62

［6］ Regunathan S，Dozier D，Takkalapalli R，et al.J Pain Palliat Care Pharmacother，2009，23（1）：35

［7］ Feng Y，Halaris A E，Piletz J E.J Chromatogr B，1997，691（2）：277

［8］ Roberts J C，Grocholski B M，Kitto K F，et al.J Pharmacol Exp Ther，2005，314（3）：1226

［9］ Mayer H K，Fiechter G，Fischer E.J Chromatogr A，2010，1217（19）：3251

［10］ Ozdestan O，Uren A.Talanta，2009，78（4）：1321

［11］ Nissim I，Horyn O，Daikhin Y，et al.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，283（6）：1123

［12］ Kawabata T，Ohshima H，Ishibashi T，et al.J Chromatogr A，1977，140（1）：47

［13］ Stickle D，Bohrer A，Berger R，et al.Anal Biochem，1996，238（2）：129

［14］ Chen G G，Turecki G，Mamer O A.J Mass Spectrom，2010，45（5）：560

［15］ Shi M，Huang Y，Li X，et al.Chromatographia，2009，70（11／12）：1651

［16］ Betancourt L，Rada P，Paredes D，et al.J Chromatogr B，2012，880：58

［17］ Huisman H，Wynveen P，Nichkova M，et al.Anal Chem，2010，82（15）：6526

［18］ Liu X，Li J G，Huang F F，et al.Chinese Journal of Chromatography（刘潇，李敬光，黄飞飞，等.色谱），2012，30（5）：468

［19］ Liu Z T，Zhang B，Wang W W，et al.Chinese Journal of Chromatography（刘芷彤，张兵，王雯雯，等.色谱），2013，31（9）：878

［20］ Wang H L，Li J T，Li J L，et al.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis（王海龙，李劲彤，李敬来，等.药物分析杂志），2005，25（2）：131