小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立与评价

陈永畅+邓之婧+陈诚+柯晶晶+吴艳秋+王向坤+何萍

[摘要] 目的 建立小鼠局灶性脑缺血再灌注（I/R）模型并予以评价。 方法 将昆明小鼠60只随机分为假手术组30只，I/R模型组30只。改良线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型。通过神经行为学评分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死比（%）、干湿重法测定脑含水量（%）及HE染色观察脑组织病理改变评价模型可靠性。 结果 模型存活率为83.33%，造模总成功率为76.67％。假手术组的小鼠神经行为学评分为0分，脑梗死比为0，脑含水量（77.29±0.45）%。I/R模型组的小鼠神经行为学评分为（2.42±0.63）分，脑梗死比为（23.03±3.42）％，脑含水量（83.18±1.65）%，均较假手术组明显增高（P<0.01）；病理检查出现典型脑梗死病理改变。 结论 改良线栓法成功建立简便、可靠的小鼠局灶性I/R模型。

[关键词] 小鼠；脑缺血再灌注；大脑中动脉阻塞；动物模型

[中图分类号] R332[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（c）-0004-04

Establishment and evaluation of focal cerebral ischemia-reperfusion model in mice

CHEN Yong-chang DENG Zhi-jing CHEN Cheng KE Jing-jing WU Yan-qiu WANG Xiang-kun HE Ping▲

Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

[Abstract] Objective To establish and evaluate the focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) model in mice. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into the sham group (n=30) and the I/R model group (n=30).The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The reliability of the model was evaluated by the neurologic behavior score,cerebral infarction rate determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method,brain water content determined by dry-wet method,and brain histopathological change observed. Results The survival rate and total success rate of the model was 83.33% and 76.67％respectively.In the sham group,the neurologic behavior score was 0 point,the cerebral infarction rate was 0,and the brain water content was(77.29±0.45)%.In the I/R group,the neurologic behavior score was(2.42±0.53)points,the cerebral infarction rate was (23.03±3.42)％,and the brain water content was(83.18±2.35)%,and compared with the sham group,the above-mentioned indicators in the I/R model group were all markedly increased (P<0.01).At the same time,the typical pathological change of cerebral infarctionwas also observed in the I/R group. Conclusion The simple and reliable focal cerebral I/R model has been successfully established by improved intraluminal filament technique in mice.

[Key words] Mice;Cerebral ischemia-reperfusion;Middle cerebral artery occlusion;Animal model

缺血性脑血管病约占全部脑血管病的80%，具有高发病率、高患病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点，已成为严重危害人类健康的三大疾病之一[1]。大脑中动脉是脑梗死的多发部位，占脑梗死的60%以上；大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型是目前使用最为广泛的、研究局灶性脑缺血再灌注损伤的理想模型，以往多采用大鼠作为研究对象[2-3]。近年来，鉴于小鼠体重差异小，模型成功率较高，其脑缺血更接近于人类脑供血不足或脑梗死再灌时脑组织病理生理演变过程等优点，故小鼠脑缺血模型成为研究脑梗死后神经细胞死亡、神经功能修复及药物保护作用的重要动物模型[4-5]，因此，建立简便、可靠、稳定的小鼠脑缺血再灌注模型是研究脑缺血再灌注损伤的重要手段。本研究探讨建立小鼠MCAO/R致局灶性脑缺血再灌注模型的方法，并对造模方法进行优化、改进及评价。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂与材料

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美国Amresco，批号2603c312）；0.6号尼龙渔线（日本YunHai公司，直径0.12 mm，批号20120312）；704硅橡胶（溧阳市宏大胶业有限公司，批号20130526）；戊巴比妥钠（美国Sigma，批号051135）。

1.2 主要仪器设备

XTZ-D解剖显微镜（上海光学五厂）；DMR+Q550病理图像分析仪（德国Leica）。

1.3 动物分组与实验方法

1.3.1 实验动物动物成年SPF级雄性昆明种小鼠60只，体质量为25~30g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK桂2003-003；随机分为假手术组30只，I/R模型组30只。

1.3.2 线栓制备尼龙渔线用锋利剃须刀片切割为4 cm/段，头端0.5 cm均匀包裹704硅橡胶，室温固化24 h后，镜下筛选头端光滑圆钝、直径为0.20~0.23 mm的线栓备用。实验前用记号笔在线栓距离头端4 mm及8~9 mm处涂色标记，浸泡于生理盐水中备用。

1.3.3 模型制备参考唐颖馨等[6-7]的方法采用改良线栓法制作小鼠MCAO/R模型并做适当改进，将线栓自颈总动脉经颈内动脉插入MCAO起始部，但手术过程中仅分离结扎颈总动脉，不分离结扎颈外动脉或翼腭动脉，也无需分离颈内动脉。腹腔注射1%戊巴比妥钠0.2 ml/只麻醉小鼠后，仰卧固定，解剖显微镜下行颈部正中切口。镜下用显微镊分离左侧颈总动脉约4 mm至颈内动脉和颈外动脉分叉处并穿双线备用，期间注意避免牵拉损伤迷走神经。结扎颈总动脉近心端并用微动脉夹在颈总动脉分叉下方夹闭颈总动脉血流后，在距离颈总动脉分叉下方约3 mm处用显微剪剪开一小口，插入线栓并用预留丝线固定在颈总动脉上，固定松紧度以能推进线栓为宜。此时松开微动脉夹，将线栓缓慢沿颈总动脉插入颈内动脉，操作过程中注意栓线走行方向勿入颈外动脉或翼腭动脉。线栓插入深度距颈总动脉分叉约4 mm时，提示线栓接近颈内动脉入颅点；插入深度距颈总动脉分叉8~9 mm时，此时有轻微阻力感，提示线栓头端到达大脑中动脉起始部。扎紧丝线以固定线栓，缝合切口，注意术后保温，待动物苏醒后单独置于饲养笼中。缺血3 h后，小心拔出栓线并结扎颈总动脉残端，再灌注24 h。假手术组只分离和结扎左侧颈总动脉，不插入线栓，其余操作步骤同I/R模型组。

1.3.4 神经行为学评分所有实验小鼠在再灌注24 h后采用Bederson评分标准[8]进行神经行为学评分。0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾时，右前肢屈曲；2分：右侧推阻力下降，伴前肢屈曲，无转圈行为；3分：同2分行为，同时伴自发性向右侧转圈；4分：没有自发活动。以神经行为学评分≥1分为模型成功标准。

1.3.5 TTC染色测定脑梗死比[9]神经行为学评分后，随机选择10只假手术组及神经行为学评分≥1分的10只I/R模型小鼠，断头取脑，置-20℃冰箱中冷冻20 min。去除嗅脑、小脑及脑干，沿脑前级和视交叉中点、视交叉、漏斗部作冠状切片，共4片。用0.5%TTC 溶液37℃孵育脑片10 min后，滤纸吸取表面液体后，分离各脑片白色区（梗死区）和红色区（正常区）后分别称重，按下式计算脑梗死比：脑梗死比（%）=（梗死区重量-脑片总重量）/脑片总重量×100%。

1.3.6 干湿重法测定脑含水量[10]神经行为学评分后，随机选择10只假手术组及神经行为学评分≥1分的10只I/R模型小鼠，断头取脑，去除嗅脑、小脑及脑干，沿中线分为左右半球后称湿重，并置100℃烘箱内24 h烘干后称干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.3.7 脑组织病理学观察神经行为学评分后，随机选择3只假手术组及神经行为学评分≥1分的3只I/R模型小鼠，全身4%多聚甲醛灌流后断头取脑， 4 μm连续冠状切片，常规HE染色后，光镜下观察脑组织病理改变。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量资料用x±s表示，采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功率和两组神经行为学评分的比较

假手术组小鼠术后无神经功能缺损症状，神经行为学评分为0分。再灌注24 h后，I/R模型组小鼠存活25只，存活率为83.33%（25/30）；其中无神经功能缺损症状者2只，经TTC染色证实无梗死灶；神经行为学评分≥1分者23只，神经行为学评分为（2.42±0.63）分，两组的神经行为学评分比较差异有统计学意义（P<0.01）。造模总成功率为76.67％（23/30）。

2.2 两组TTC染色及脑梗死比的比较

假手术组脑片TTC染色呈全脑均匀红染，未见白色梗死灶，脑梗死比为0；I/R模型组脑片出现左侧皮层及皮层下白色梗死区，主要集中在第2、3脑片，脑梗死比为（23.03±3.42）％，两组的脑梗死比比较差异有统计学意义（P<0.01）。小鼠脑TTC染色见图1。

图1 小鼠脑TTC染色结果

A.假手术组；B.I/R模型组

2.3 两组脑含水量的比较

假手术组左右脑对称，脑含水量为（77.29±0.45）%；I/R模型组可见左侧大脑体积增大，脑含水量为（83.18±1.65）％，两组的脑含水量比较差异有统计学意义（P<0.01）。

2.4 两组脑组织病理改变的比较

假手术组皮层和纹状体神经元数量、形态结构正常，神经纤维密集，排列整齐。I/R模型组缺血侧脑组织可见大量筛状坏死灶，坏死灶内神经元数量明显减少，出现核固缩、浓染；神经纤维稀疏，排列紊乱，间隙扩大；间质水肿明显。小鼠脑组织病理学变化见图2。

图2 小鼠脑组织病理学变化图（HE染色，400×）

A.假手术组；B.I/R模型组

3 讨论

3.1 实验动物的选择

动物品系的选择对MCAO模型的成功率／术后梗死体积的大小及区域有一定的影响[11]。杜芳等[12]研究认为，线栓法制作昆明小鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型创伤小，缺血的部位较恒定，可以准确控制缺血和再灌注时间，可以成为研究脑血管疾病的病理生理改变、预后及治疗作用的理想实验动物模型；与BALB/c小鼠（另一种常用于制备MCAO/R模型的小鼠），昆明小鼠制作MCAO/R模型的存活率、模型成功率明显高于BALB/c小鼠，而梗死体积仅略低于BALB/c小鼠，因此，本研究采用昆明小鼠建立MCAO/R模型，并对造模方法进行优化改进。

3.2 线栓的制备及进栓深度

线栓是MCAO模型制备成功的关键因素之一[13]。704硅橡胶是一种黏接性好、高强度、无腐蚀的单组分室温硫化硅橡胶，具有安全无毒、可塑性好、常温固化、使用方便等特点。与常用的石蜡包裹线栓相比，704硅橡胶包裹的线栓形状均匀一致，头端包裹圆润，栓体光滑及固化后不易损伤变形或脱落等，从而提高模型成功率和稳定性。

进栓深度是MCAO模型制作成功的另一重要因素。关于小鼠MCAO模型进线深度的报道不多，多推荐进线深度超过颈总动脉分叉处8～9 mm[7，14]。本研究发现，对于昆明小鼠，插入深度以超过颈总动脉分叉处8 mm 为宜，进线过深则会导致梗死面积过大，动物死亡率增高。

线栓除了在距离头端8~9 mm处涂色标记外，还增加了距离头端4 mm处进行标记。4 mm标记点有助于判断线栓是否入颅，8~9 mm标记点则有助于判断线栓头端是否到达大脑中动脉起始部，由此提高线栓插入成功率。

3.3 进栓方式的选择

线栓法制备MCAO模型不需要开颅，侵入性小，操作方便并且可以产生相对稳定的脑缺血病灶，术后动物生存状态稳定，但longa传统线栓法[2，14]从颈外动脉断端插入线栓至大脑中动脉，需要分离结扎颈外动脉远端及其所有分支，造模时间长，动物出血多，死亡率高。目前在制备大鼠MCAO模型中常用改良线栓法，术中将线栓自颈总动脉经颈内动脉插入大脑中动脉起始部，使大脑中动脉供血区域产生局灶性脑缺血；拔除线栓后，依靠Wills环由对侧颈总动脉供血而实现再灌[15]。昆明种小鼠的Willis环解剖结构相对稳定，变异较少，后交通动脉多发育良好，90%有完整的Willis环[16]，因此采用改良线栓法制备MCAO模型后拔除线栓，仍可通过Willis环达到再灌的目的。

改良线栓法[6，7，15]操作中，常分离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以防止线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭位置选择在颈内动脉，因此需分离颈内动脉起始段，由此造成手术时间延长、手术难度加大，甚至导致术中出血、动物死亡。本研究尝试仅分离结扎颈总动脉，不分离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是通过调整插入线栓插入方向将线栓插入颈内动脉；同时将颈总动脉开口选择在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因而微动脉夹夹闭位置可以选择在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因而也无需分离颈内动脉。手术方式更简单，手术时间通常可控制在10 min内完成，同时也降低了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的损害，提高动物术后恢复能力，降低死亡率。

3.4 模型的评价

经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑组织病理改变检测，I/R模型组小鼠造模后出现明显神经功能缺损症状，神经行为学评分明显高于假手术组；脑组织TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦明显高于假手术组，脑组织病理符合脑缺血再灌注损伤病理改变，提示造模成功。

综上所述，本研究成功采用改良线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改良方法制作简单易行，成功率较高，结果稳定、可靠，可用于脑缺血再灌注的研究。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-03-26本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研究生教育创新计划项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目

[作者简介] 陈永畅（1985-），女，籍贯：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研究生，主要从事神经药理学研究

▲通讯作者：何萍（1975-），女，籍贯：湖南岳阳，教授，硕士生导师，主要从事神经药理学研究

改良线栓法[6，7，15]操作中，常分离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以防止线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭位置选择在颈内动脉，因此需分离颈内动脉起始段，由此造成手术时间延长、手术难度加大，甚至导致术中出血、动物死亡。本研究尝试仅分离结扎颈总动脉，不分离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是通过调整插入线栓插入方向将线栓插入颈内动脉；同时将颈总动脉开口选择在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因而微动脉夹夹闭位置可以选择在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因而也无需分离颈内动脉。手术方式更简单，手术时间通常可控制在10 min内完成，同时也降低了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的损害，提高动物术后恢复能力，降低死亡率。

3.4 模型的评价

经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑组织病理改变检测，I/R模型组小鼠造模后出现明显神经功能缺损症状，神经行为学评分明显高于假手术组；脑组织TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦明显高于假手术组，脑组织病理符合脑缺血再灌注损伤病理改变，提示造模成功。

综上所述，本研究成功采用改良线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改良方法制作简单易行，成功率较高，结果稳定、可靠，可用于脑缺血再灌注的研究。

[参考文献]

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[14]赵瑾，苑琳，王驭龙，等.线栓法复制昆明小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的稳定性研究[J].中国病理生理杂志，2011，27（7）：1450-1452，1456.

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（收稿日期：2014-03-26本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研究生教育创新计划项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目

[作者简介] 陈永畅（1985-），女，籍贯：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研究生，主要从事神经药理学研究

▲通讯作者：何萍（1975-），女，籍贯：湖南岳阳，教授，硕士生导师，主要从事神经药理学研究

改良线栓法[6，7，15]操作中，常分离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以防止线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭位置选择在颈内动脉，因此需分离颈内动脉起始段，由此造成手术时间延长、手术难度加大，甚至导致术中出血、动物死亡。本研究尝试仅分离结扎颈总动脉，不分离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是通过调整插入线栓插入方向将线栓插入颈内动脉；同时将颈总动脉开口选择在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因而微动脉夹夹闭位置可以选择在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因而也无需分离颈内动脉。手术方式更简单，手术时间通常可控制在10 min内完成，同时也降低了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的损害，提高动物术后恢复能力，降低死亡率。

3.4 模型的评价

经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑组织病理改变检测，I/R模型组小鼠造模后出现明显神经功能缺损症状，神经行为学评分明显高于假手术组；脑组织TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦明显高于假手术组，脑组织病理符合脑缺血再灌注损伤病理改变，提示造模成功。

综上所述，本研究成功采用改良线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改良方法制作简单易行，成功率较高，结果稳定、可靠，可用于脑缺血再灌注的研究。

[参考文献]

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（收稿日期：2014-03-26本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研究生教育创新计划项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目

[作者简介] 陈永畅（1985-），女，籍贯：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研究生，主要从事神经药理学研究

▲通讯作者：何萍（1975-），女，籍贯：湖南岳阳，教授，硕士生导师，主要从事神经药理学研究