不同产地桑叶药材UPLC指纹图谱研究

2014-08-08 16:31彭丽英彭攸灵杨先国
中国当代医药 2014年14期
关键词:指纹图谱桑叶

彭丽英+彭攸灵+杨先国

[摘要] 目的 建立不同产地桑叶UPLC指纹图谱。 方法 采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脱,检测波长为358 nm,流速为0.6 ml/min,柱温40℃,进样体积1 μl。 结果 建立了桑叶专属性的UPLC指纹图谱,确定了15个共有峰,不同产地桑叶样品具有较好的相似度。结论 UPLC指纹图谱方法重复性好,简便可靠,可用于桑叶的快速鉴别,可以为桑叶的质量控制和市场应用提供依据。

[关键词] 桑叶;指纹图谱;超高效液相色谱法

[中图分类号] R286[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721(2014)05(b)-0008-04

Study on UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions

PENG Li-ying PENG You-ling YANG Xian-guo▲

Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou412012,China

[Abstract] Objective To establish UPLC fingerprint of Morus alba L. from different regions. Methods Column ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm)was used.The mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid water with gradient elution.The detection wave-lengths was 358 nm and column temperature was 40℃ with the flow rate of 0.6 ml/min.The sample injection was 1 μl. Results A specificity fingerprint chromatogram was produced and 15 characteristic peaks were designated.The results showed that the collected samples had a good similarity. Conclusion UPLC fingerprint is a reliable,available and quick method of quality control of Morus alba L. and it is necessary for the safe and practicable use of the medicine.

[Key words] Morus alba L.;Fingerprint;UPLC

桑叶为桑科植物桑(Morus alba L.)的叶,初露后采收,除去杂质,晒干,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效,主要用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花[1]。桑叶药食两用,现代研究表明桑叶具有降血糖[2-4]、降血压[5]、降血脂、抗炎、抗衰老[6]、抗肿瘤[7]等功效,在药用和食品保健方面都发挥了重要作用。目前,桑叶的质量控制主要集中于芦丁和绿原酸含量的测定[8-12],除芦丁外,其他黄酮类化合物也是桑叶质量控制的热点[13-16]。随着国内外市场对桑叶的需求愈来愈大,桑叶的质量也参差不齐。课题组认为中药是多成分、多环节、多靶点的药物,质量控制也需要体现中药特色,仅靠单一或几个指标难以衡量质量的优劣。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性,符合中医中药整体性和模糊性的特点[17]。课题组为了进一步控制桑叶质量,采用UPLC方法,对从全国收集的桑叶药材进行指纹图谱进行研究。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);JA51002型电子分析天平(岛津);Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统,Empower工作站,含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器(Waters公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯,TEDIA公司),乙腈(色谱纯,TEDIA公司),水为娃哈哈纯净水,磷酸(色谱纯,北京化工厂)。

1.3 对照品及药材

对照品异槲皮苷和紫云英苷,购于成都植标化纯生物技术有限公司,供含量测定用,批号分别为PCS0371-lot 120510和PCS0468-lot 120328;对照品芦丁购于中国食品药品检定研究院,批号为0080-9705。不同产地的桑叶药材11批,均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑(Morus alba L.)的叶,药材批号及来源见表1。

表1 桑叶药材批号及来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50.0 mm,1.7 μm);流速:0.6 ml/min;检测波长:358 nm;柱温:40℃;进样体积:1 μl;流动相:甲醇(A)-0.2%磷酸水(B)梯度洗脱,洗脱程序:0→22 min,10%A→32%A。

2.2 供试品溶液的制备

药材粉碎,过60目筛,取药粉约0.5 g,精密称定,置于100 ml三角瓶中,加入75%甲醇50 ml,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,用75%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品异槲皮苷、芦丁和紫云英苷适量,用75%甲醇溶解,定容,得到其浓度分别为0.092、0.042、0.054 μg/μl。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验取同一批桑叶供试品(20080305),按照2.2项的方法制备供试品溶液1份,按照上述色谱条件,连续进样6次,测定指纹图谱。以10号峰(图1)的保留时间和峰面积为参照,计算样品中所含15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰的相对保留时间的RSD<0.5%,相对峰面积的RSD<1.0%,表明仪器的精密度良好。

图1 桑叶药材共有模式指纹图谱

2.4.2 重复性试验按上述方法平行制备同一批桑叶供试品(20080305),测定指纹图谱。考察样品中所含有15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积,各色谱峰的相对保留时间的RSD<0.5%,相对峰面积的RSD<1.0%,提示方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验同一批桑叶供试品(20080305)溶液,分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定,以各峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察,桑叶样品24 h各色谱峰的相对保留时间的RSD<0.5%,相对峰面积的RSD<1.0%,表明桑叶样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批,按照2.2下方法制备供试品溶液,分别进样1 μl,记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2.0版)进行分析,生成共有模式指纹图谱,有15个共有峰(图1),其中以峰10(S峰)为参照物,其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件,得共有指纹图谱(图2),对照品溶液的色谱图见图3,经与对照品对照,指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989,以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究,与HPLC相比,UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内,更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物,在75%甲醇中有相对较好的溶解度,选择75%甲醇超声,样品前处理简单、可控;样品呈弱酸性,选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相;选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶,与乙腈相比更加安全和便宜;波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大,且杂质干扰较少;梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明,不同批次桑叶样品相似度计算结果均>0.85,表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定,当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2010:279.

[2]李超,潘建明,罗新根,等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学,2012,23(2):18-20.

[3]陈建国,步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药,2011,42(3):515-520.

[4]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学,2005,31(4):418-421.

[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿,2008,(12):43.

[6]王灿,左艇,王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报,2011,8(3):30-32.

[7]杨燕,王洪庆,陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报,2010,(1):77-81.

[8]周美环,赵书楷,陈淼,等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(5):228-229.

[9]雷霖,何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志,2012,22(3):468-469.

[10]郭红霞,谢文剑,曹艺,等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药,2014,21(4):17-19.

[11]徐韧柳,李丽华,康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志,2005,12(1):53-54.

[12]孙莲,张丽静,孟磊,等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药,2003,34(1):78-79.

[13]严安定,袁野,吴亮,等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药,2011,15(3):296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技,2013,(4):43-44.

[15]张亮亮,汪咏梅,徐曼,等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药,2013,24(5):1064-1066.

[16]张强,孙长波,张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版,2011,(3):73-74.

[17]李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药,2013,44(22):3095-3104.

(收稿日期:2014-04-08本文编辑:李亚聪)

[作者简介] 彭丽英(1977-),女,湖南怀化人,本科,主管中药师,主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者:杨先国(1977-),男,湖南桃源人,讲师,博士,主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批,按照2.2下方法制备供试品溶液,分别进样1 μl,记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2.0版)进行分析,生成共有模式指纹图谱,有15个共有峰(图1),其中以峰10(S峰)为参照物,其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件,得共有指纹图谱(图2),对照品溶液的色谱图见图3,经与对照品对照,指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989,以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究,与HPLC相比,UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内,更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物,在75%甲醇中有相对较好的溶解度,选择75%甲醇超声,样品前处理简单、可控;样品呈弱酸性,选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相;选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶,与乙腈相比更加安全和便宜;波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大,且杂质干扰较少;梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明,不同批次桑叶样品相似度计算结果均>0.85,表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定,当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2010:279.

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[3]陈建国,步文磊.桑叶多糖降糖作用及其机制研究[J].中草药,2011,42(3):515-520.

[4]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学,2005,31(4):418-421.

[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿,2008,(12):43.

[6]王灿,左艇,王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报,2011,8(3):30-32.

[7]杨燕,王洪庆,陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报,2010,(1):77-81.

[8]周美环,赵书楷,陈淼,等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(5):228-229.

[9]雷霖,何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志,2012,22(3):468-469.

[10]郭红霞,谢文剑,曹艺,等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药,2014,21(4):17-19.

[11]徐韧柳,李丽华,康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志,2005,12(1):53-54.

[12]孙莲,张丽静,孟磊,等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药,2003,34(1):78-79.

[13]严安定,袁野,吴亮,等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药,2011,15(3):296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技,2013,(4):43-44.

[15]张亮亮,汪咏梅,徐曼,等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药,2013,24(5):1064-1066.

[16]张强,孙长波,张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版,2011,(3):73-74.

[17]李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药,2013,44(22):3095-3104.

(收稿日期:2014-04-08本文编辑:李亚聪)

[作者简介] 彭丽英(1977-),女,湖南怀化人,本科,主管中药师,主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者:杨先国(1977-),男,湖南桃源人,讲师,博士,主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 指纹图谱共有模式的建立取桑叶药材样品11批,按照2.2下方法制备供试品溶液,分别进样1 μl,记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2.0版)进行分析,生成共有模式指纹图谱,有15个共有峰(图1),其中以峰10(S峰)为参照物,其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2。

2.5.2 共有峰的确定11批桑叶药材样品导入软件,得共有指纹图谱(图2),对照品溶液的色谱图见图3,经与对照品对照,指认10、11、12号峰分别为异槲皮苷、芦丁、紫云英苷。

2.5.3 指纹图谱的相似度评价上述11批桑叶样品相似度计算结果依次为0.970、0.968、0.967、0.896、0.941、0.983、0.983、0.918、0.964、0.994、0.989、0.989,以上数据表明桑叶各批次相似性较好。

3 讨论

本次实验选用UPLC开展桑叶指纹图谱研究,与HPLC相比,UPLC方法快速简便、稳定可靠。本次桑叶指纹图谱实验分析时间在22 min内,更加快捷和节约溶剂。

本实验根据桑叶中主要成分为黄酮类、酚酸类化合物,在75%甲醇中有相对较好的溶解度,选择75%甲醇超声,样品前处理简单、可控;样品呈弱酸性,选择极低浓度的磷酸水溶液作为水相;选择甲醇作为有机相来分析中药桑叶,与乙腈相比更加安全和便宜;波长选择358 nm也是基于主要化合物在该波长处吸收相对最大,且杂质干扰较少;梯度选择均一梯度变化以保证样品具有更好的重复性。

相似度结果表明,不同批次桑叶样品相似度计算结果均>0.85,表明所收集的桑叶药材质量相对均一稳定,当然也与药用桑叶样品只有一种来源有关。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2010:279.

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[4]罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有效成份测定[J].蚕业科学,2005,31(4):418-421.

[5]阎百传.霜桑叶稳定了我的血压[J].长寿,2008,(12):43.

[6]王灿,左艇,王琳琳.桑叶黄酮抗皮肤衰老实验研究[J].中国医药导报,2011,8(3):30-32.

[7]杨燕,王洪庆,陈若芸.桑叶中的黄酮类化合物[J].药学学报,2010,(1):77-81.

[8]周美环,赵书楷,陈淼,等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(5):228-229.

[9]雷霖,何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].中国卫生检验杂志,2012,22(3):468-469.

[10]郭红霞,谢文剑,曹艺,等.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国当代医药,2014,21(4):17-19.

[11]徐韧柳,李丽华,康怀萍.RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量[J].中国中医药信息杂志,2005,12(1):53-54.

[12]孙莲,张丽静,孟磊,等.RP-HPLC法测定桑叶中绿原酸的含量[J].中草药,2003,34(1):78-79.

[13]严安定,袁野,吴亮,等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药,2011,15(3):296-298.

[14]吴羽艳.桑叶中总黄酮的含量测定方法研究[J].轻工科技,2013,(4):43-44.

[15]张亮亮,汪咏梅,徐曼,等.不同品种桑叶多酚和黄酮含量变化规律研究[J].时珍国医国药,2013,24(5):1064-1066.

[16]张强,孙长波,张晶.桑叶中多糖和总黄酮的含量测定[J].吉林农业·学术版,2011,(3):73-74.

[17]李强,杜思邈,张忠亮,等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药,2013,44(22):3095-3104.

(收稿日期:2014-04-08本文编辑:李亚聪)

[作者简介] 彭丽英(1977-),女,湖南怀化人,本科,主管中药师,主要从事中药鉴定与中药调剂、中药质量标准的教学与科研工作

▲通讯作者:杨先国(1977-),男,湖南桃源人,讲师,博士,主要研究方向为中药鉴定与质量控制研究

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