六月雪水提取物促凝血作用及机制的研究

钟海利+郑志燕+廖细平+黄德强+张世琨

[摘要] 目的 研究六月雪水提取物促凝血的作用及机制。 方法 将清洁级SD大鼠60只随机分为生理盐水组、低剂量SSD组（1.5 g/kg六月雪水提取物组）、高低剂量SSD组（3.0 g/kg六月雪水提取物组）。采用体外血浆法测定体外凝血时间，采用凝血因子分析仪测定凝血酶时间、凝血酶原时间、优球蛋白溶解时间。 结果 与生理盐水对照组比较，低、高剂量SSD组的六月雪水提取物能明显缩短体外凝血时间（P<0.05，P<0.01）、血浆凝血酶时间（P<0.05，P<0.01）、凝血酶原时间（P<0.05，P<0.01），且明显延长优球蛋白溶解时间（P<0.05，P<0.01）。 结论 1.5、3.0 g/kg的六月雪水提取物具有明显的促凝血作用，其作用机制可能与缩短血浆凝血酶时间、凝血酶原时间及升高优球蛋白溶解时间有关。

[关键词] 六月雪水提取物；凝血酶时间；凝血酶原时间；优球蛋白溶解时间

[中图分类号] R965.2[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（c）-0011-03

Research on procoagulant role and mechanism of Serissa serissoides (DC.) Druce water extract

ZHONG Hai-li1 ZHENG Zhi-yan1 LIAO Xi-ping2 HUANG De-qiang1 ZHANG Shi-kun1

1.Department of Pharmacy,the First Hospital Affiliated to Nanchang University,Nanchang 330006,China;2.People′s Hospital of Xinyu City in Jiangxi Province,Xinyu 338000,China

[Abstract] Objective To study the procoagulant role and mechanism of Serissa serissoides (DC.) Druce (SSD) water extract. Methods 60 SD rats of clean grade were randomly divided into the saline group,the low dose SSD group (1.5 g/kg SSD extract group),the high dose SSD group (3 g/kg SSD water extract group). The clotting time in vitro was determined by plasma method in vitro,and the thrombin time, prothrombin time, euglobulin lysis time were determined by coagulation factor analyzer. Results Compared with the saline group,SSD water extract of the low dose SSD group,the high dose SSD group can significantly shorten clotting time in vitro (P<0.05, P<0.01),thrombin time (P<0.05, P<0.01),prothrombin time (P<0.05, P<0.01) and significantly prolong the euglobulin lysis time (P<0.05, P<0.01). ConclusionSSD water extract of 1.5 g/kg and 3.0g/kg has the role of distinct blood coagulation.The mechanism may be related to reduced plasma thrombin time, prothrombin time and increased euglobulin lysis time.

[Key words] Serissa serissoides (DC.) Druce water extract;Thrombin time;Prothrombin time;Euglobulin lysis time

六月雪为茜草科六月雪属植物六月雪[Serissa serissoides（DC.）Druce（SSD）][1]，是民间常用的一种草药，主要用于治疗病毒性肝炎及肝硬化。六月雪含有5-乙酰基-6-羟基-2-异丙烯苯并呋喃；5-乙酰基-0-羟基-2-丙酮苯并呋喃；邻苯二甲酸二乙酯；β-谷甾醇；豆甾醇[2]。相鲁闽等[3]报道了六月雪治疗小儿疳积，陈文吟等[4]报道了六月雪提取物体外抗乙肝病毒等作用，六月雪还具有抑菌作用、对实验性胃黏膜损伤的保护作用、治疗肾脏疾病、提高免疫功能等作用[5-10]，复方六月雪还具有体外抗HBV作用[11]。对六月雪水提取物促凝血作用及机制的研究未见报道。本实验主要研究六月雪水提取物的促凝血作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 六月雪水提取物的制备取干六月雪300 g，加双蒸水过液面2 cm，煮沸2次，30 min/次，合并滤液，浓缩至600 ml。加3倍量95%的乙醇，放冰箱静置过夜，次日减压过滤，并回收滤液中乙醇，继续浓缩滤液得无醇味的水提取物。提取物加双蒸水至300 ml使药液为相当于生药1 g/ml。用0.5%NaOH调整pH为7.0。置冰箱中备用。

1.1.2 试验动物健康成年SD大鼠（江西中医学院实验动物中心提供），体重300～400 g，雌雄各半，随机分组。

1.1.3 药品与试剂10%的水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20110407）；枸橼酸钠（1∶9）真空采血管（江西富尔康实业集团有限公司，批号：20110903）；凝血酶原时间测定试剂盒和凝血酶时间测定试剂盒（上海太阳生物技术有限公司）。

1.1.4 仪器凝血因子分析仪（美国海伦娜）。

1.2 统计学处理

所有数据运用SPSS 14.0统计软件包进行单因素方差分析，计量资料以x±s表示，组间两两比较采用 t 检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2方法与结果

2.1 分组及给药[12-13]

清洁级SD大鼠60只，随机分为3组：生理盐水对照组、低剂量SSD组（1.5 g/kg六月雪水提取物组）；高剂量SSD组（3.0 g/kg六月雪水提取物组）。给药组每天以相应量的药物灌胃，生理盐水对照组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，持续5 d。

2.2 六月雪水提取物对体外凝血时间的测定

实验前动物禁食12 h，末次给药后0.5 h，以10%的水合氯醛麻醉（0.35 ml/100g），用毛细管从眼睛内眦部插入眼底，血液即进入毛细管内，直至血液从毛细管内流出，舍弃第1滴，然后取洁净玻片接一滴血（直径约5 mm），并按下秒表开始计时，每10~20秒用清洁6号针头自血滴边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝为止即为凝血时间，记录凝血时间（表1）。

表1 六月雪水提取物对大鼠体外玻片凝血时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.3 六月雪水提取物对凝血酶原时间的测定

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入37℃预温的凝血活酶0.2 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶原时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图1）。

2.4 六月雪水提取物对凝血酶时间的测定

眼眦取血后，暴露大鼠腹腔，分离腹主静脉，用枸橼酸钠抗凝（1∶9）真空采血管自腹主静脉采血2 ml，轻轻摇匀，后3000 r/min离心15 min，取上清夜，即待测血浆。

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入凝血酶0.1 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图2）。

图2 六月雪水提取物对凝血酶时间的影响

与生理盐水组比较，*P<0.05；**P<0.01，n=5

2.5 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的测定

SD大鼠，体重为（200±20）g，心脏采血1.8 ml，0.1 mol/L草酸铵1∶9抗凝，3000 r/min离心10 min，分离贫血小板血浆。取0.5 ml新鲜血浆，按文献方法[12-13]制得纤维蛋白凝块，加不同浓度的六月雪水提取物，对照组加生理盐水，37℃孵育，记录凝块完全溶解时间（表2）。

表2 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05；#P<0.01

3 讨论

凝血过程是一个多因子参与的复杂过程，既可由血管内膜损伤激活的“内源途径”所引发，也可由血管外的凝血因子与血液接触而启动的“外源途径”所引发。凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内源性和外源性凝血系统功能状况的变化。

茜草科六月雪属植物六月雪具有对实验性胃黏膜损伤的保护作用，因此我们对六月雪水提取物进行了促凝血作用及机制的研究。本研究结果显示，1.5、3.0 g/kg的六月雪水提取物能明显缩短体外凝血时间（P<0.05，P<0.01），抑制率达26.9%、33.1 %，说明六月雪水提取物具有良好的促凝血作用，且在一定程度具有剂量依赖性；同时六月雪水提取物还能明显缩短血浆凝血酶时间（P<0.05，P<0.01）、凝血酶原时间（P<0.05，P<0.01）和明显延长优球蛋白溶解时间（P<0.05，P<0.01）。结果表明，六月雪水提取物的促凝血作用机制可能与缩短血浆凝血酶时间、凝血酶原时间和延长优球蛋白溶解时间有关。同时还说明六月雪水提取物既能影响内源性凝血途径，又能作用于外源性凝血途径。

本研究为六月雪的促凝血作用提供了有利的基础实验证据，但其对各凝血因子的影响程度如血浆纤维蛋白原水平、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间国际标准比值的影响还有待进一步探讨。

致谢：感谢赣南医学院曾靖教授对本项目的指导和所作的贡献。

[参考文献]

[1]谢宗万.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1996：207.

[2]韦万兴，黄美艳.六月雪化学成分研究[J].广西大学学报·自然科学版，2008，33（2）：148-150.

[3]相鲁闽，相鲁建.白马骨治疗小儿疳积[J].中国民间疗法，2001，9（1）：59.

[4]陈文吟，余宙耀，郑茉莉，等.白马骨根水提取物的体外抗乙肝病毒作用[J].湖南中医学院学报，1997，17（4）：44-46.

[5]刘敏，邓兆群，屈雪菊，等.六月雪的抑菌作用[J].武汉大学学报·医学版，2002，23（2）：167-168.

[6]范小娜，李洪亮，肖海，等.二味中草药对实验性胃黏膜损伤的保护作用[J].辽宁中医杂志，2007，34（11）：1648-1649.

[7]李洪亮，程齐来，范小娜，等.六月雪水提取物对实验性胃黏膜损伤的修复作用[J].时珍国医国药，2009，20（2）：333-334.

[8]孙响波，于妮娜.六月雪治疗肾脏疾病探源[J].中医药导报，2013，（10）：127-128.

[9]王红爱，黄位耀，张云，等.六月雪不同组分提取物的抗菌解热作用研究[J].临床合理用药杂志，2011，04（29）：3-5.

[10]朱秋萍，李洪亮，范小娜，等.六月雪提取物对小鼠免疫作用的影响[J].赣南医学院学报，2007，27（1）：11-12.

[11]杨霞芳，张士军，黄春喜，等.复方六月雪体外抗HBV的实验研究[J].内科，2007，2（3）：317-319.

[12]赵欣宇，宋鉴清，张丽霞，等.标本放置时间对凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间检测结果的影响[J].中国医科大学学报，2012，41（7）：656-658.

[13]蒋义，郁施青，安邦权，等.4种凝血机制抗凝管抗凝效果对比研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（9）：1150-1151

（收稿日期：2014-01-22本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 江西省卫生厅科技计划项目（20133035）

[作者简介] 钟海利（1974-），男，江西瑞金人，汉族，2003年毕业于江西中医学院药学专业，本科，学士，副主任药师，研究方向：临床药学

表1 六月雪水提取物对大鼠体外玻片凝血时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.3 六月雪水提取物对凝血酶原时间的测定

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入37℃预温的凝血活酶0.2 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶原时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图1）。

2.4 六月雪水提取物对凝血酶时间的测定

眼眦取血后，暴露大鼠腹腔，分离腹主静脉，用枸橼酸钠抗凝（1∶9）真空采血管自腹主静脉采血2 ml，轻轻摇匀，后3000 r/min离心15 min，取上清夜，即待测血浆。

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入凝血酶0.1 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图2）。

图2 六月雪水提取物对凝血酶时间的影响

与生理盐水组比较，*P<0.05；**P<0.01，n=5

2.5 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的测定

SD大鼠，体重为（200±20）g，心脏采血1.8 ml，0.1 mol/L草酸铵1∶9抗凝，3000 r/min离心10 min，分离贫血小板血浆。取0.5 ml新鲜血浆，按文献方法[12-13]制得纤维蛋白凝块，加不同浓度的六月雪水提取物，对照组加生理盐水，37℃孵育，记录凝块完全溶解时间（表2）。

表2 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05；#P<0.01

3 讨论

凝血过程是一个多因子参与的复杂过程，既可由血管内膜损伤激活的“内源途径”所引发，也可由血管外的凝血因子与血液接触而启动的“外源途径”所引发。凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内源性和外源性凝血系统功能状况的变化。

茜草科六月雪属植物六月雪具有对实验性胃黏膜损伤的保护作用，因此我们对六月雪水提取物进行了促凝血作用及机制的研究。本研究结果显示，1.5、3.0 g/kg的六月雪水提取物能明显缩短体外凝血时间（P<0.05，P<0.01），抑制率达26.9%、33.1 %，说明六月雪水提取物具有良好的促凝血作用，且在一定程度具有剂量依赖性；同时六月雪水提取物还能明显缩短血浆凝血酶时间（P<0.05，P<0.01）、凝血酶原时间（P<0.05，P<0.01）和明显延长优球蛋白溶解时间（P<0.05，P<0.01）。结果表明，六月雪水提取物的促凝血作用机制可能与缩短血浆凝血酶时间、凝血酶原时间和延长优球蛋白溶解时间有关。同时还说明六月雪水提取物既能影响内源性凝血途径，又能作用于外源性凝血途径。

本研究为六月雪的促凝血作用提供了有利的基础实验证据，但其对各凝血因子的影响程度如血浆纤维蛋白原水平、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间国际标准比值的影响还有待进一步探讨。

致谢：感谢赣南医学院曾靖教授对本项目的指导和所作的贡献。

[参考文献]

[1]谢宗万.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1996：207.

[2]韦万兴，黄美艳.六月雪化学成分研究[J].广西大学学报·自然科学版，2008，33（2）：148-150.

[3]相鲁闽，相鲁建.白马骨治疗小儿疳积[J].中国民间疗法，2001，9（1）：59.

[4]陈文吟，余宙耀，郑茉莉，等.白马骨根水提取物的体外抗乙肝病毒作用[J].湖南中医学院学报，1997，17（4）：44-46.

[5]刘敏，邓兆群，屈雪菊，等.六月雪的抑菌作用[J].武汉大学学报·医学版，2002，23（2）：167-168.

[6]范小娜，李洪亮，肖海，等.二味中草药对实验性胃黏膜损伤的保护作用[J].辽宁中医杂志，2007，34（11）：1648-1649.

[7]李洪亮，程齐来，范小娜，等.六月雪水提取物对实验性胃黏膜损伤的修复作用[J].时珍国医国药，2009，20（2）：333-334.

[8]孙响波，于妮娜.六月雪治疗肾脏疾病探源[J].中医药导报，2013，（10）：127-128.

[9]王红爱，黄位耀，张云，等.六月雪不同组分提取物的抗菌解热作用研究[J].临床合理用药杂志，2011，04（29）：3-5.

[10]朱秋萍，李洪亮，范小娜，等.六月雪提取物对小鼠免疫作用的影响[J].赣南医学院学报，2007，27（1）：11-12.

[11]杨霞芳，张士军，黄春喜，等.复方六月雪体外抗HBV的实验研究[J].内科，2007，2（3）：317-319.

[12]赵欣宇，宋鉴清，张丽霞，等.标本放置时间对凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间检测结果的影响[J].中国医科大学学报，2012，41（7）：656-658.

[13]蒋义，郁施青，安邦权，等.4种凝血机制抗凝管抗凝效果对比研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（9）：1150-1151

（收稿日期：2014-01-22本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 江西省卫生厅科技计划项目（20133035）

[作者简介] 钟海利（1974-），男，江西瑞金人，汉族，2003年毕业于江西中医学院药学专业，本科，学士，副主任药师，研究方向：临床药学

表1 六月雪水提取物对大鼠体外玻片凝血时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05，#P<0.01

2.3 六月雪水提取物对凝血酶原时间的测定

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入37℃预温的凝血活酶0.2 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶原时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图1）。

2.4 六月雪水提取物对凝血酶时间的测定

眼眦取血后，暴露大鼠腹腔，分离腹主静脉，用枸橼酸钠抗凝（1∶9）真空采血管自腹主静脉采血2 ml，轻轻摇匀，后3000 r/min离心15 min，取上清夜，即待测血浆。

取待测血浆0.1 ml，37℃水浴孵育3 min，加入凝血酶0.1 ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为凝血酶时间值（s）。每个样品重复实验5次，取其平均值（图2）。

图2 六月雪水提取物对凝血酶时间的影响

与生理盐水组比较，*P<0.05；**P<0.01，n=5

2.5 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的测定

SD大鼠，体重为（200±20）g，心脏采血1.8 ml，0.1 mol/L草酸铵1∶9抗凝，3000 r/min离心10 min，分离贫血小板血浆。取0.5 ml新鲜血浆，按文献方法[12-13]制得纤维蛋白凝块，加不同浓度的六月雪水提取物，对照组加生理盐水，37℃孵育，记录凝块完全溶解时间（表2）。

表2 六月雪水提取物对优球蛋白溶解时间的影响（x±s，n=5）

与生理盐水组比较，*P<0.05；#P<0.01

3 讨论

凝血过程是一个多因子参与的复杂过程，既可由血管内膜损伤激活的“内源途径”所引发，也可由血管外的凝血因子与血液接触而启动的“外源途径”所引发。凝血时间和凝血酶原时间可分别反映内源性和外源性凝血系统功能状况的变化。

茜草科六月雪属植物六月雪具有对实验性胃黏膜损伤的保护作用，因此我们对六月雪水提取物进行了促凝血作用及机制的研究。本研究结果显示，1.5、3.0 g/kg的六月雪水提取物能明显缩短体外凝血时间（P<0.05，P<0.01），抑制率达26.9%、33.1 %，说明六月雪水提取物具有良好的促凝血作用，且在一定程度具有剂量依赖性；同时六月雪水提取物还能明显缩短血浆凝血酶时间（P<0.05，P<0.01）、凝血酶原时间（P<0.05，P<0.01）和明显延长优球蛋白溶解时间（P<0.05，P<0.01）。结果表明，六月雪水提取物的促凝血作用机制可能与缩短血浆凝血酶时间、凝血酶原时间和延长优球蛋白溶解时间有关。同时还说明六月雪水提取物既能影响内源性凝血途径，又能作用于外源性凝血途径。

本研究为六月雪的促凝血作用提供了有利的基础实验证据，但其对各凝血因子的影响程度如血浆纤维蛋白原水平、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间国际标准比值的影响还有待进一步探讨。

致谢：感谢赣南医学院曾靖教授对本项目的指导和所作的贡献。

[参考文献]

[1]谢宗万.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1996：207.

[2]韦万兴，黄美艳.六月雪化学成分研究[J].广西大学学报·自然科学版，2008，33（2）：148-150.

[3]相鲁闽，相鲁建.白马骨治疗小儿疳积[J].中国民间疗法，2001，9（1）：59.

[4]陈文吟，余宙耀，郑茉莉，等.白马骨根水提取物的体外抗乙肝病毒作用[J].湖南中医学院学报，1997，17（4）：44-46.

[5]刘敏，邓兆群，屈雪菊，等.六月雪的抑菌作用[J].武汉大学学报·医学版，2002，23（2）：167-168.

[6]范小娜，李洪亮，肖海，等.二味中草药对实验性胃黏膜损伤的保护作用[J].辽宁中医杂志，2007，34（11）：1648-1649.

[7]李洪亮，程齐来，范小娜，等.六月雪水提取物对实验性胃黏膜损伤的修复作用[J].时珍国医国药，2009，20（2）：333-334.

[8]孙响波，于妮娜.六月雪治疗肾脏疾病探源[J].中医药导报，2013，（10）：127-128.

[9]王红爱，黄位耀，张云，等.六月雪不同组分提取物的抗菌解热作用研究[J].临床合理用药杂志，2011，04（29）：3-5.

[10]朱秋萍，李洪亮，范小娜，等.六月雪提取物对小鼠免疫作用的影响[J].赣南医学院学报，2007，27（1）：11-12.

[11]杨霞芳，张士军，黄春喜，等.复方六月雪体外抗HBV的实验研究[J].内科，2007，2（3）：317-319.

[12]赵欣宇，宋鉴清，张丽霞，等.标本放置时间对凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间检测结果的影响[J].中国医科大学学报，2012，41（7）：656-658.

[13]蒋义，郁施青，安邦权，等.4种凝血机制抗凝管抗凝效果对比研究[J].国际检验医学杂志，2013，34（9）：1150-1151

（收稿日期：2014-01-22本文编辑：许俊琴）

[基金项目] 江西省卫生厅科技计划项目（20133035）

[作者简介] 钟海利（1974-），男，江西瑞金人，汉族，2003年毕业于江西中医学院药学专业，本科，学士，副主任药师，研究方向：临床药学