exendin-4预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响

鲁佳佳，胡笑容，胡钢英，江洪

论著·基础

exendin-4预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响

鲁佳佳，胡笑容，胡钢英，江洪

目的探讨exendin-4(Ex-4)预处理对大鼠缺血/再灌注(I/ R)损伤的影响。方法雄性SD大鼠55只随机分为4组：假手术组(SO)(n=10), 缺血/再灌注(I/R)组(n=15),Ex-4+I/R (Ex-4-I/R)组(n=15), Ex-4+ exendin (9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R]组(n=15)。除SO组外，其余3组大鼠均行冠状动脉左前降支结扎，缺血30 min后再灌4 h，Ex-4-I/R组在I/R前给予Ex-4预处理，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组在I/R前给予Ex-4和Ex(9-39)预处理。再灌注4h后进行心肌梗死面积评估，并取颈动脉血进行心肌酶、心肌氧化指标、心肌高迁移率族蛋白1(HMGB1)水平检测。结果缺血再灌注4h后，与I/R组比较，Ex-4-I/R组心肌梗死面积减少，分别为(54.1±3.0)%和(25.8±1.0)%，差异有统计学意义(P<0.05)；与Ex-4-I/R组比较，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组心肌梗死面积增大，为(47.8±3.0)%，差异有统计学意义(P<0.05)。与SO组比较，I/R组LDH、CK、MDA水平明显增加，HMGB1表达明显升高(P<0.05)，而SOD水平明显下降(P<0.05)；与I/R组比较，Ex-4-I/R组各项指标明显改善，差异有统计学意义(P<0.05)；与Ex-4-I/R组比较，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组中各项指标的改善均被抑制，差异有统计学意义(P<0.05)。结论Ex-4预处理可能通过抑制HMGB1的表达进而减轻大鼠心肌I/R损伤。

exendin-4；心肌缺血/再灌注；高迁移率族蛋白1；大鼠

高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一类广泛分布在高等真核生物细胞核内的非染色体核蛋白，它能够调控基因转录并且维持核小体的结构。HMGB1可以由坏死细胞、凋亡细胞释放，也可以由固有免疫细胞(如巨噬细胞和单核细胞)释放[1，2]。HMGB1已经在一些心血管疾病中被确定为一种促炎性细胞因子[3～5]。近期发现HMGB1如同一些经典的早期促炎性细胞因子——肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)一样，作为早期炎性介质在心肌缺血/再灌注(I/R)中发挥作用，并能促进TNF-α和IL-6的释放。然而HMGB1的A盒(一种HMGB1的特异性拮抗剂)能抑制TNF-α和IL-6的释放，减轻心肌的I/R损伤[6]。炎性反应被认为是心肌I/R损伤的一个关键性因素[7，8]。这些结果表明，HMGB1在心肌I/R损伤中发挥重要作用。

胰升糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，是一种在进食后受到营养素刺激而由小肠内L细胞分泌的肠道促胰岛激素，已经被证实可以在2型糖尿病(DM)血糖调节中发挥作用[9]。exendin-4 (Ex-4)是1种针对GLP-1受体的激动剂，由39个氨基酸组成，已经证实它能激活GLP-1受体，增加胰腺腺泡细胞胞内cAMP浓度，同时对(VIP)受体没有影响，它有着和GLP-1类似的功能。越来越多的证据表明，不管是在动物模型还是患者的心血管疾病中，包括心肌I/R，GLP-1和Ex-4都具有显著的有益作用[10～13]。最近，Cai等[14]研究发现，Ex-4能抑制心肌细胞在高糖条件下诱导的HMGB1表达。因此，我们推测，Ex-4通过抑制HMGB1表达可以预防心肌I/R损伤。本研究主要是通过大鼠心肌I/R模型，探讨Ex-4预处理是否能抑制心肌I/R损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物： SPF级雄性SD大鼠55只(武汉大学医学院动物实验中心提供)，体质量250～300 g，实验过程中动物饲养及取材均按照实验动物管理和保护的有关规定进行。术前12 h禁食、不禁饮。大鼠55只随机分为4组：假手术组(SO，n=10), 缺血/再灌注(I/R)组(n=15),Ex-4+I/R(Ex-4-I/R)组(n=15),Ex-4+exendin(9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R]组(n=15)。(2)药物及试剂：3%戊巴比妥钠，Ex-4、Ex(9-39) (GLP-1受体拮抗剂，购自美国Sigma公司)。仪器：Biopac多导生理记录仪、计算机图像分析系统(Image-Pro Plus3.0，Media Cyerneties公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立： 用3%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔麻醉大鼠。麻醉成功后，取仰位固定，气管插管连接动物呼吸机，频率70次/min，潮气量3～4 ml/100 g。用不锈钢电极插入大鼠四肢皮下，连接，持续记录标准肢体II导联心电图。沿胸骨左缘第3～4肋间打开胸腔，暴露心室前壁，剪开心包膜，在左心耳与肺动脉圆锥之间穿入5-0丝线，结扎左冠状动脉前降支(LAD)，结扎时先打一松结，松结内垫一带凹槽的空心乳胶管，待心电图恢复稳定后，在凹槽处拉紧围绕在乳胶管上的结扎线以压迫LAD，结扎后心电图II导联ST段明显上抬及心脏表面相应区域由红润变为紫绀和苍白表明缺血成功；结扎30 min后沿凹槽剪断结扎线，取出乳胶管，再灌注4 h。以ST段回落1/2以上、心脏表面缺血区发绀变红表明心肌组织再灌注成功。SO组：LAD下穿线，不结扎血管。I/R组：LAD结扎30 min后再灌注4 h。Ex-4-I/R组：LAD结扎前1 h，大鼠经Ex-4(5 μg/kg, 溶于无菌生理盐水静脉注射)，处理[15，16]，再结扎LAD 30 min后再灌注4 h。Ex-4-Ex(9-39)-I/R组：LAD结扎前1 h，经Ex-4 (5 μg/kg, 溶于无菌生理盐水静脉注射)和Ex(9-39)(5 μg/kg, 溶于无菌生理盐水静脉注射)预处理[17]，再结扎LAD 30 min后再灌注4 h。

1.2.2 心肌梗死面积评估： 再灌注4 h后，将LAD原位重新结扎，经股静脉注射1.5%伊文思蓝染料2 ml，待缺血区显示清晰后立即摘取心脏，冰PBS液冲洗后，立即置于-20℃冰箱中冷冻15 min，继之沿垂直心脏左室长轴切成厚为1～2 mm的心肌切片，置入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑溶液(TTC溶液，TTC溶于浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液PBS，pH 7.4)中，37℃避光恒温孵育20 min[18]。存活心肌被TTC染成红色 ，而梗死心肌为白色。孵育结束后，取出心肌组织在透明纸上描出轮廓，扫描后输入计算机图像分析系统，测定梗死区与缺血区(左心室的区域)面积。计算梗死区和缺血区面积百分比来评估心肌梗死面积。

1.3 观测项目

1.3.1 心肌酶检测： 再灌注4 h后，经颈动脉取血2 ml，以3 000 r/min离心15 min，提取上清，保持在-20℃直至分析。根据试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书，测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的表达水平。

1.3.2 心肌氧化指标检测： 取缺血区心肌组织，按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定心肌组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，分别作为心肌组织中氧自由基和脂质过氧化物水平指标。

1.3.3 心肌HMGB1的测定： 参照文献[19]，取缺血区心肌组织，使用HMGB1抗体(Santa Cruz，USA)检测HMGB1含量，用定量免疫印迹法进行分析。以GAPDH表达作为内参标准，计算HMGB1表达的相对量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行分析。计量资料以均数±标准差表示，2组间比较采用t检验；单因素方差分析或Welch检验用于多组间比较；LSD检验或 Dunnett-t检验用于多组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌梗死面积 再灌注4 h后心肌梗死面积，与I/R组(54.1±3.0)%比较，Ex-4-I/R组(25.8±1.0)%可降低大鼠心肌I/R所诱发的心肌梗死面积(P<0.05)；Ex-4-Ex(9-39)-I/R组为(47.8±3.0)%，与Ex-4-I/R组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明Ex(9-39)抑制了Ex-4在心肌梗死面积上的保护作用。

2.2 LDH和CK水平 再灌注4 h后，与SO组比较，I/R组LDH和CK水平明显增加(P<0.05)，与I/R组比较，Ex-4-I/R组LDH和CK水平下降(P<0.05)；与Ex-4-I/R组比较，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组水平又上升(P<0.05)，Ex(9-39)抑制了Ex-4在心肌酶上的保护作用。见表1。

表1 各组大鼠LDH和CK表达水平的比较

注：与SO组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05；与Ex-4-I/R组比较，cP<0.05

2.3 MDA和SOD水平 再灌注4 h后，与SO组相比，I/R组MDA的水平明显增加，而SOD水平明显下降(均P<0.05)；与I/R组比较，Ex-4-I/R组MDA含量的下降、SOD含量增加(P<0.05)；与Ex-4-I/R组比较，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组MDA含量增加，SOD含量下降，表明Ex(9-39)抑制了Ex-4在氧化应激方面的作用。见表2。

表2 Ex-4预处理对MDA和SOD表达水平的影响

注：与SO组比较，aP<0.05；与I/R组比较，bP<0.05；与Ex-4-I/R组比较，cP<0.05

2.4 HMGB1的表达 再灌注4 h后，与SO组(0.098±0.018)相比，I/R组HMGB1(0.327±0.026)表达明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，Ex-4-I/R组表达明显下降(0.149±0.013)，差异有统计学意义(P<0.05)；与Ex-4-I/R组比较，Ex-4-Ex(9-39)-I/R组(0.279±0.023)显著升高，说明Ex(9-39)抑制了Ex-4在HMGB1表达上的保护作用。见图1。

注：1.SO组；2.I/R组；3.Ex-4-I/R组；4.Ex-4-Ex(9-39)-I/R组

3 讨 论

研究表明，GLP-1和GLP-1受体激动剂能减轻心肌I/R损伤，改善心功能[10～12,20]。炎性反应和细胞凋亡在心肌I/R损伤中发挥关键作用。Bose等[21]研究首次阐明了GLP-1在完整大鼠离体心脏中对抗心肌梗死的作用，提出GLP-1可能通过激活多种激酶如蛋白激酶A、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等抑制心肌细胞的凋亡，从而保护心肌。Hu等[22]研究表明，HMGB1可以促进心肌细胞凋亡，且呈剂量依赖性。Zhu等[23]等发现，HMGB1经HMGB1-TLR4-IL-23-IL-17A轴，通过巨噬细胞-γδT细胞—中性粒细胞级联反应，加剧炎性反应，同时促进细胞凋亡，从而影响再灌注损伤。HMGB1拮抗剂能减轻心肌I/R损伤，抑制早期促炎细胞因子，如TNF-α和IL-6的释放，表明抑制HMGB1的表达能抑制炎性反应，减轻心肌I/R损伤。本结果发现，Ex-4-I/R组较I/R组大鼠的心肌梗死面积明显缩小，LDH、CK水平明显降低，减轻心肌I/R损伤。同时，发现Ex-4-I/R组较I/R组HMGB1的表达量也明显降低。同时，使用GLP-1受体拮抗剂会抑制Ex-4对心肌I/R损伤的保护作用和减弱对HMGB1表达的抑制作用。因此，我们推测Ex-4可能通过抑制HMGB1表达抑制炎性反应，减轻心肌I/R损伤。

此外，氧化应激是造成心肌缺血再灌注损伤的另一个重要机制，它能导致心肌细胞的结构损伤和功能代谢障碍。Tang等[24]报道，过氧化氢能够刺激巨噬细胞和单核细胞释放HMGB1，加重微血管损伤。又有研究表明，抗氧化剂可以抑制HMGB1表达，通过抗炎、抗氧化应激减轻肝脏再灌注损伤[25]，进一步表明抑制活性氧可抑制HMGB1表达。本结果发现Ex-4-I/R组较I/R组的MDA水平明显降低、SOD水平显著升高。提示Ex-4可能通过抑制I/R引起的氧化应激，进而抑制HMGB1的表达，最终减轻心肌I/R损伤。

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Effectsofpreconditioningwithexendin-4onmyocardialischemia/reperfusioninjuryinrats

LUJiajia,HUXiaorong,HUGangying,JIANGHong.

DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

JIANGHong，E-mail:jianghwurm@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of exendin 4 (Ex-4) preconditioning on rat ischemia/reperfusion (I/ R) damage.MethodsFifty-five male SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group (SO) (n=10), ischemia / reperfusion (I/R) group (n=15),EX4+I/R (Ex-4-I/R) group (n=15), Ex-4+exendin (9-39)[Ex-4-Ex(9-39)-I/R] group (n=15). Except SO group, the other 3 group rats underwent left anterior descending coronary artery ligation, after 30 min ischemia, reperfusion of 4 h, Ex-4-I/R group was given Ex-4 before I/R pretreatment, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group was given Ex-4 and Ex-(9-39) preconditioning before I/R group. After reperfusion for 4h, then assessed of the myocardial infarction area, and get the carotid artery blood sample to test the myocardial enzyme, myocardial oxidative index, myocardial high mobility group protein 1 (HMGB1) levels.Results4h after reperfusion, compared with group I/R, Ex-4-I/R group reduced myocardial infarct size more obviously, (54.1±3)% and (25.8±1)% respectively, the difference was statistically significant (P<0.05) compared with Ex-4-I/R group, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group myocardial infarction area increases, as of (47.8±3.0)%,the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with SO group, I/R group's LDH, CK, MDA levels were significantly increased, HMGB1 expression was significantly increased (P<0.05), and SOD level decreased significantly (P<0.05); compared with I/R group, Ex-4-I/R group's indicators improved significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); compared with the Ex-4-I/R group, Ex-4-Ex(9-39)-I/R group's indicators improvement were suppressed, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionIt demonstrated that the Ex-4 preconditioning may inhibit the expression of HMGB1 and reduce the myocardial I/R injury in rats.

exendin-4;Myocardial ischemia/reperfusion injury;High mobility group protein 1;Rats

国家自然科学基金资助项目(No.81100146，No.81370308)

430060 武汉大学人民医院心血管内科

江洪，E-mail:jianghwurm@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.018

2014-04-13)