湖北三峡地区松材线虫的耐寒性1)

黄瑞芬 高瑞贺 石 娟 宋德文 李祖梅

(北京林业大学，北京，100083) (夷陵区黄花乡林业管理站)

湖北三峡地区松材线虫的耐寒性1)

黄瑞芬 高瑞贺 石 娟 宋德文 李祖梅

(北京林业大学，北京，100083) (夷陵区黄花乡林业管理站)

为了探究松材线虫的耐寒性，以采自湖北省宜昌市夷陵区的松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)为试验对象，研究低温及低温驯化对松材线虫存活情况的影响。结果表明：松材线虫有较强的耐低温能力，在10、5、0、-5、-10 ℃低温条件下，随着处理时间的延长，松材线虫存活率逐渐降低，各温度半致死时间分别为20.17、35.63、30.65、1.17 d，其中-10 ℃低温条件下短暂暴露，线虫全部死亡。此外，在0 ℃和5 ℃条件下经不同时间驯化后，-5 ℃暴露处理24 h，松材线虫的存活率显著提高，表明松材线虫耐寒性随着驯化时间的延长显著提高，但是0 ℃和5 ℃两种驯化温度对松材线虫的耐寒性增加差异不显著。

松材线虫；耐寒性；低温驯化

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)是一种世界性的植物检疫性有害生物，分布于热带、亚热带地区，尤其是松林种植区分布广泛，是对松林危害最严重的一种植物病原线虫。我国于1982年在南京中山陵的黑松上首次发现松材线虫病以来，据我国林业局公布最新的疫区公告[1]可知，疫情已扩大到陕西、河南、安徽和山东等15个省，对我国森林生态系统造成不可估量的损失。松材线虫病的扩散和发生过程中，环境因素起着极为重要的作用，其中温度是最重要的影响病害发生的环境非生物因子之一，也是限制松材线虫病分布的主要气候因子[2]。根据日本的研究发现[3]，松材线虫病在年平均气温低于10 ℃的地区不发生；在年平均气温10～12 ℃的地区能够生存，零星发生危害；在年平均气温12～14 ℃的地区可以流行；在年平均气温高于14 ℃的地区可暴发流行。但据我国松材线虫疫区调查发现[4]，在林间感染松材线虫的松树有在越年春季死亡的现象，而且在一些年平均温度为8 ℃左右的高海拔地区也有松材线虫病的发生。因此，在不同生境条件下，松材线虫繁殖型需要忍受低温，且具有一定的耐受低温的能力。松材线虫对低温的适应能力是决定其在自然条件下存活和分布的重要因素之一。截止目前，国内外对于松材线虫的耐寒性研究较少，基于此，笔者以采自湖北省宜昌市夷陵区的松材线虫为试验对象，研究低温及低温驯化对松材线虫存活情况的影响，旨在对松材线虫的耐寒性研究提供基础资料。

1 材料与方法

松材线虫的收集及鉴定：松材线虫样品来自湖北省宜昌市夷陵区疫区，用贝曼漏斗法从马尾松(Pinusmassoniana)中分离收集线虫，将供试线虫在65 ℃的水浴下处理2 min，FG固定液(福尔马林+甘油)固定，在Leica DMLB2生物显微镜下观察线虫形态特征。形态测计用De Man公式。参照谢辉分类系统[5]确定各线虫分类地位。

松材线虫的接种及培养：接灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌丝块至PDA培养基上，在25 ℃下经4～7 d，菌丝铺满培养皿后，挑取经形态鉴定的、发育健全的并表面消毒过的松材线虫50条雌虫和50条雄虫(用0.52%次氯酸钠表面消毒)接种至灰葡萄孢菌丝上，置于25 ℃条件下培养，待线虫将菌丝被吃完2/3左右，即可获得纯化好的大量虫株，分离收集并于4 ℃条件保存备用。

低温处理方法：配置大约3 000条·mL-1线虫悬浮液(1.0 mL)转移到1.5 mL的离心管中，根据试验要求分别放置到10、5、0、-5、-10 ℃的低温反应浴中，-5 ℃下分别于0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0 d观察线虫的存活率，其他温度间隔10 d观察线虫的存活率，连续观察6次。每个处理5次重复。

低温驯化处理：设0、5 ℃为驯化温度。处理前，大量培养松材线虫，待灰葡萄孢菌丝吃完2/3左右，将培养皿分别置于驯化温度处理1、3、5、7 d，驯化完成之后分离线虫，配制浓度为3 000条·mL-1的线虫悬浮液，置于-5 ℃进行低温暴露试验。并将25 ℃培养的线虫作为对照组进行相同处理，重复5次。

线虫的活力观察与计数：将处理过的线虫在室温下分离后放置24 h后，摇匀吸取约100 μL线虫，经物理刺激(用移液枪吹打数次)后，显微镜下观察，能进行较强地卷曲和伸展运动的、头部有轻微卷曲，或尾部微弱摆动的线虫均判为存活线虫；不动的线虫判为死亡线虫。用计数器对活虫和死虫进行计数，计算其存活率。

数据处理：利用SPSS统计软件对低温暴露试验所得的结果进行概率分析，用Duncan多重比较分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 0 ℃以上低温对松材线虫存活的影响

0、5、10 ℃的低温暴露试验表明(表1)，松材线虫对0 ℃以上的低温表现出较强的适应性，处理20d后存活率仍高于70%，但随处理时间的延长，松材线虫的存活率显著降低。松材线虫在10 ℃的存活时间比5 ℃和0 ℃要短，10 ℃处理30 d后存活率显著下降至27.43%，50 d后存活率率为0，而经5 ℃和0 ℃处理60 d的存活率分别为15.73%和13.59%。且10、5、0 ℃处理下松材线虫的LT50分别为20.17、35.63、30.65 d，其中5 ℃和0 ℃显著高于10 ℃，原因可能是松材线虫在10 ℃的主要致死因素不是低温，而是由于线虫本身的新陈代谢速度加快，导致营养物质消耗过快而在短时间内快速死亡所致。5 ℃以下随温度降低LT50的值逐渐缩短，但两者间无显著差异。随着0 ℃和5 ℃处理时间的延长，显微镜下观察线虫的角质膜会增厚，体腔内内含物浓稠，逐渐呈深黑色，部分活虫体的肠区和生殖系统会出现油状类脂质体，这种形态结构的变化能使松材线虫更好的适应不良环境，这可能也是后期线虫存活率下降速度减慢的原因。

表1 0 ℃以上低温对松材线虫存活率的影响

注：表中数据为平均值+标准误，同列数据后不同字母表示不同处理间差异显著(p<0.05)。

2.2 0 ℃以下低温对松材线虫存活的影响

松材线虫在-5、-10 ℃低温下处理不同时间后的存活率如表2所示。由表2可知：松材线虫的存活率随处理天数的增加而显著下降，相对于0 ℃以上低温(表1)，松材线虫对0 ℃以下的低温适应能力显著减弱。-5 ℃处理1 d，存活率显著下降为50.28%；处理6 d，松材线虫的存活率仅为7.16%。-5 ℃的LT50的值为1.17 d。-10 ℃处理12 h后，松材线虫存活率为0。

表2 0 ℃以下低温对松材线虫存活率的影响

注：表中数据为平均值+标准误，同列数据后不同字母表示不同处理间差异显著(p<0.05)。

2.3 低温驯化效应

松材线虫经5 ℃和0 ℃不同时间的驯化处理后，在-5 ℃检测驯化效果，结果表明(表3)：-5 ℃暴露处理24 h后，经0、5 ℃驯化处理3d的松材线虫的存活率显著高于未经驯化的(p<0.05),存活率分别提高至58.8%和62.3%；经7 d驯化处理的，存活率进一步显著提高到86.76%和90.70%，且随驯化时间的延长，耐寒性的差异显著(p<0.05)，但是对0 ℃和5 ℃两种驯化温度对松材线虫的耐寒性增加作用不显著(p>0.05)。

3 结论与讨论

实验室条件下，将经真菌培养所得的松材线虫置于2～5 ℃冷藏保存，可存活数月之久，表明松材线虫对0 ℃以上温度具有较强的适应性。张建平等[4]的研究表明：在线虫悬浮液中加入20%的甘油，线虫在-20 ℃条件下可以存活8 d，在实验室内证实了松材线虫的繁殖期虫态对短时0 ℃以下低温的抗逆性。但张建平等[4]并未进行松材线虫在不同低温下的存活时间的研究。

表3 低温驯化的松材线虫在-5 ℃暴露处理下的存活率

注：表中数据为平均值+标准误，同列数据后不同字母表示不同处理间差异显著(p<0.05)。

本研究设置了5个低温梯度探索低温对松材线虫存活率的影响，结果显示，随着低温处理时间的延长，松材线虫的存活率逐渐降低。其中10 ℃处理50 d后松材线虫的存活率为0，5 ℃存活率为37.4%，0 ℃存活率为27.64%，后期松材线虫的存活率变化率降低。相比0 ℃以上的温度，0 ℃以下的温度松材线虫存活时间显著下降，-5 ℃处理短期存活率迅速下降，5 d后存活率为16.67%，当温度降到-10 ℃时，短时间内全部死亡。低温暴露试验显示：繁殖型线虫能够耐受0 ℃以上的低温胁迫，但不能很好地在0 ℃以下的低温环境中存活，这与己有的线虫耐寒性机制的研究报道不同。在节肢动物的耐寒性研究中，耐寒性并不局限在耐冻和避冻两种类型内，还包括耐受寒冷型、寒冷敏感型以及机会主义型[6-7]。对于寒冷敏感型动物，其特点是能在0 ℃到5 ℃存活，在-5 ℃到-15 ℃短暂的冷暴露会增加其死亡率。因此，认为繁殖型松材线虫属于寒冷敏感型，这与戴素明等的研究结果[8]一致。

一些南极线虫(Panagrolaimusdavidi)冬季种群的过冷却点低于夏季种群的过冷却点。过冷却点的转变说明线虫具有驯化效应，经过低温驯化后的线虫耐寒性会显著增强，这种驯化效应在其它线虫也得到证明[9-13]。Wharton等[14]研究表明，南极线虫在5 ℃和0 ℃的驯化下，能提高线虫在-12 ℃低温处理下的存活率，驯化时间对存活率的影响差异显著，但是驯化温度差异不显著，这与本研究结果一致。本试验结果表明，松材线虫是可驯化的，在5、0 ℃条件下随着驯化时间的延长，耐寒性会显著提高，但是两个驯化温度差异不显著。在松材线虫相对适应性较强的温度下进行低温驯化，其耐寒性表现出随驯化时间的延长而增强的趋势，这可能与松材线虫内部的新陈代谢调节有关。Zhao等[15]研究表明，松材线虫在4、0 ℃条件下处理60 d后，幼虫和成虫的形态结构都会发生变化，角质层增厚，呈深黑色，肠区出现油滴状类脂质体，对低温等恶劣环境有较强的抵抗力。线虫经低温锻炼，可诱发生物体产生一些抗冷冻的低分子物质产生，从而耐寒性得到增强。研究表明，南极线虫经过驯化后海藻糖含量显著增加，且海藻糖的含量对线虫长期的低温存活率有显著的影响[13]。类似的研究结果也可在昆虫病原线虫Steinernemafeltiae和Heterorhabditisbacteriophora耐寒性机制研究中得到，经过低温驯化后，海藻糖的含量在5 ℃比25 ℃时显著增加[16-17]。类似的结果在松材线虫中也存在，冷激后的松材线虫体内的海藻糖含量增加了48.78%，说明海藻糖的聚集与低温有关[7]，但其与松材线虫耐寒性的相关性还有待进一步的研究。

松材线虫生活史中虽然存在着繁殖型和分散型两个阶段，而且其主要以分散3龄型越冬，但是松材线虫病会在一些常年低温的高海拔地区发生，说明繁殖型松材线虫对低温有一定的适应性，耐寒性的研究对于松材线虫病在一个国家和地区的分布能否向北扩散并建立稳定的种群及成功预测预报和根治害虫方面都起着至关重要的作用，并且能为明确松材线虫的生活史对策、生理生化调节和选择进化机制，以及明确其发生扩散原因、种群发生趋势和种群控制措施等提供理论依据。

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Cold Tolerance ofBursaphelenchusxylophilusin the Three Gorges Region of Hubei Province

/Huang Ruifen, Gao Ruihe, Shi Juan

(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Song Dewen, Li Zumei(Station of Forestry Management of Huanghua Town Yiling District)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(11).-138～141

In order to explore the cold tolerance ofBursaphelenchusxylophilus, we tookB.xylophilusfrom Yiling District, Yichang City, Hubei Province to examine how low temperature and cold acclimation affected survival rate ofB.xylophilus.B.xylophiluswas relatively cold resistant with median level, and the survival rate decreased with the increase of cold exposure time. The median lethal time ofB.xylophiluswere 20.17, 35.63, 30.65 and 1.17 days at 10 ℃, 5 ℃, 0 ℃ and -5 ℃, respectively, and all died at -10 ℃ for short exposure. The survival rates ofB.xylophiluswere enhanced significantly at -5 ℃ for 24 hours’ exposure after different time acclimation at 5 ℃ and 0 ℃. The cold acclimation enhanced the cold tolerance ofB.Xylophilus, and there was a positive correlation between the acclimation and cold tolerant, but there was no significant cold tolerant increase at 5 ℃ and 0 ℃.

Bursaphelenchusxylophilus; Cold tolerance; Cold acclimation

1) 国家林业公益性行业科研专项(201204501)；国家自然科学基金面上项目(31170613)；北京高等学校青年英才计划资助(YETP0740)。

黄瑞芬，女，1989年8月生，北京林业大学林学院，硕士研究生。

石娟，北京林业大学林学院，副教授。E-mail：shi_juan@263.net。

2014年3月20日。

S763.301；Q959.17

责任编辑：程 红。