非水相固定化生物催化的研究进展

丁东慧，于炜婷，刘袖洞，马小军

（1大连大学环境与化学工程学院，辽宁 大连116622；2中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连116023）

随着绿色化学的稳定发展和社会可持续发展需求，传统化学工业的高消耗、高污染已经成为亟待解决的问题。在日益注重生产效率和环境保护的氛围下，基于酶和微生物细胞的生物催化技术也取得突破性进展［1］，尤其是在生产精细化学品和药物的工艺中，一些更加绿色和可持续的生物催化工艺正在取代传统的化学合成路径［2］；而且，为了克服底物或产物溶解度低、产物抑制等限制，对于需要高选择性的一些精细化学品、手性中间体及药物合成的工艺中还引入了非水相介质。相比于水相生物催化，非水相生物催化有很多潜在的优势：如更高的底物溶解性、水解反应的可逆性以及修饰酶的特异性［3］。

目前，在非水相生物催化的研究与应用中，人们依靠现代分析技术和精确的计算，对于催化剂活性、微观酶结构、分子动力学和溶剂极性之间的关系有了深入的认识。例如，精确计算是利用计算机模拟非水相生物催化，从分子水平对酶行为细节进行研究，获取活性和选择性等有价值的信息，再将其与实验结合，能够更加全面地认识非水相生物催化过程［4］。

同时，为了实现生物催化过程的工业应用，更多的研究侧重于如何提高生物催化剂活性和选择性等方面。这主要涉及两部分：一个是溶剂工程，即通过改变酶促反应的介质环境以调节酶活性和底物选择性等性质的酶工程技术；另一个是生物催化工程，即通过筛选极端微生物、酶的改造和工程手段，提高生物催化剂的溶剂耐受性或者调节活性等，如定向筛选、蛋白质工程和固定化技术［2］。

1 非水相介质

生物催化系统主要由底物及产物、反应介质、生物催化剂三个基本要素构成。在非水相生物催化过程中，选择条件温和且无污染的反应介质［5］对于可持续发展尤其重要。

1.1 常规的水－有机溶剂介质

生物催化体系研究中，水－有机溶剂系统是研究相对全面的非水相介质。添加有机溶剂一方面能够提高疏水性底物的利用率、降低底物或产物对生物催化剂的抑制；另一方面也可能影响生物催化剂活性和选择性。因此，在选择有机溶剂的时候必须综合考虑上述两个方面的影响［2，6］。

Kansal等［7］首先研究了有机溶剂与水形成的两相体系对假丝酵母菌（C.viswanathii）活性的影响，包括二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、异丙醇、正丙醇、己醇、苯、庚醇、己烷、癸醇和庚烷等12种溶剂。在水∶溶剂比为1∶1时，细胞活性保持率在己烷中最高（59%）而在DMSO中最低，表明较高的溶剂浓度（50%，体积比）对微生物是高毒性的。以苯乙酮为底物，在水－异丙醇（10%，体积比）中转化率高达94%、对映体过量值（ee）＞99%；在水－乙醇和水－己烷中也都高于80%，优于水相中76%的转化率，但是水－己烷中的ee值为96%；而且添加异丙醇还增强了高温下的操作稳定性，45℃、50℃下均得到90%的转换率和＞99%的ee值。上述结果说明低浓度溶剂对细胞活性影响较小，通过提高底物溶解度可以实现较高的转化率，而选择不同溶剂还可以调控酶的选择性。此外，将细胞固定在海藻酸钙凝胶中，在高浓度水－己烷（50%，体积比）两相中细胞活性保持率达91%，远高于游离细胞的59%，表明固定化技术可以提高细胞在高浓度有机溶剂中的长期稳定性。

Cheng等［8］研究了酵母细胞中乙醇脱氢酶在水／己烷两相体系中合成手性1－苯基－1－正丁醇的过程。在只含有辅因子Zn2＋的水相体系中（无己烷），（S）－1－苯基－1－正丁醇的产量是65.3%，ee值是93.0%；而在含有40%己烷的两相体系中，（R）－1－苯 基－1－正 丁 醇 产 量 是9.6%，ee值 是90.9%。表明选择合适的水－有机溶剂两相可以影响对酶的对映选择性。

侯丹丹等［9］研究了海藻酸钠－壳聚糖微胶囊固定化酵母菌的生长代谢情况，结果显示，在水－癸二酸二丁酯两相中，微囊内酵母细胞活性保持良好，微囊内细胞的生长未受影响；底物L－苯丙氨酸的浓度在8～16g／L范围内，生物催化生产2－苯乙醇的过程呈现高转化率，2－苯乙醇产量达4.5g／L，初步验证了海藻酸钠－壳聚糖微胶囊体系用于非水相催化的可行性。

Costas等［10］研究了有机溶剂对果胶微球固定化脂肪酶稳定性的影响。结果表明，固定化脂肪酶在正己烷、正十四烷和正庚烷中的稳定性与水相中类似，但在异丁醇、己醇等溶剂存在时稳定性显著下降。而且，将脂肪酶包埋在钙离子交联的果胶凝胶中，其在70%水－有机溶剂互溶体系中酶活性比单纯水相中提高3～4倍。

Kapoor等［11］研究了4－硝基苯甲醛和乙酰乙酸乙酯的脱羧羟醛反应，通过大孔丙烯酸载体固定化念珠菌，在60%的乙腈和40%水的反应介质中合成4－羟基－4－（4－硝基苯基）－丁酮－2－酮，反应72小时产率达99%。同时，为了提高反应速率以及增加产量，实验中添加了30%（摩尔分数）的咪唑，速率从原来的85μmol／（L·min·mg）增加到了557μmol／（L·min·mg），产 率 在14h就 得 到98%，该结果表明，固定化念珠菌细胞在水－溶剂介质中具有很好的反应活性，而适当使用添加剂，能够促进非水相介质中的生物转化过程，有利于商业过程开发。

为了尽可能避免有机溶剂的不利影响，上述例子均结合了固定化技术，利用固定化载体能尽量避免生物催化剂与溶剂直接接触，以降低溶剂的相毒性，因此增强了生物催化剂的活性和稳定性，有利于反应向产物合成的方向进行。

1.2 新型非水相体系

近几年来，除了致力于筛选具有合适物化性能和生物相容性的有机溶剂以及构建不同的水－有机溶剂组合，人们也尝试一些新型非水相介质的应用，如将离子液体和超临界二氧化碳流体等绿色溶剂应用于生物催化与生物转化研究中。

1.2.1 离子液体

离子液体也被叫做熔化盐，是由有机阳离子和不同阴离子组成的有机熔盐。典型的离子液体是二烷基阳离子与弱阴离子（如MeOSO3或者PF6）的混合物。高级的离子液体胆碱柠檬酸盐可生物降解，比较便宜，并且是毒性较小的阴离子和阳离子的组合［12－13］，因此有望用于生物催化并扩大到工业生产。

Maruyama等［14］研究发现，尽管天然脂肪酶粉末在离子液体中活性较低，但仍能将乙酸乙烯酯与2－苯基－1－丙醇醇解为2－苯基－1－丙基乙酸；当采用聚乙二醇（PEG）固定化脂肪酶，其在离子液体1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸盐（［Bmim］［PF6］）中的反应活性明显提高，在45℃下反应6h的产率就比游离酶高50%左右。同时比较了固定化脂肪酶在离子液体［Bmim］［PF6］、1－己基－3－甲基咪唑六氟磷酸盐（［Hmim］［PF6］）、1－辛基－3－甲基咪唑六氟磷酸盐（［Omim］［PF6］）和有机溶剂n－正己烷、异辛烷、DMSO、乙腈中的最初反应速率，离子液体中的速率比有机溶剂中要高出4倍左右。而且，PEG固定化脂肪酶在离子液体中醇解具有相对高的对映选择性，在［Bmim］［Tf2N］中，ee值是98%，比［Hmim］［PF6］中的80%和［Omim］［PF6］中的77%要高，而后两种离子液体的对映选择性与在n－正己烷中是相当的，这些结果表明并不是所有的离子液体能够提高对映选择性，应该进行合适的筛选，以达到期望的结果，同时也表明将离子液体与固定化技术结合用于生物催化有很大的优势。

Shah等［15］将脂肪酶固定在多层碳纳米管上，研究了其在非水相介质中的性能。实验选取了两种非水相介质进行对比，一个是己烷－水系统，与游离酶相比，固定化脂肪酶使得酯基转移速率增加了22倍，丁酸丁酯的产率从14%增加到64%；另一个是离子液体［Bmim］［PF6］系统，速率增加14倍，产率达71%，而且固定化脂肪酶显著提高了对映选择性，ee值超过99%。通过比较可看出，固定化脂肪酶在离子液体中的活性及选择性要优于常规的水－有机溶剂系统。

分析认为，通过对阳离子和阴离子的适当组合或者改性可以调节离子液体极性和物质溶解性能，因此，它作为生物催化过程中的非水相介质表现出较强的底物或者产物溶解能力，进而会降低底物或者产物对生物催化剂的抑制作用；而且离子液体也不会破坏细胞膜，表现出较小的细胞和生物毒性，对于生物催化剂的活性、稳定性和选择性有一定增强作用［16－17］。另外，离子液体的使用还能够简化产品分离过程。尽管上述研究表明离子液体作为一种新型非水相介质，在生物催化过程中具有一定的优越性，但是其在生物催化中的应用仍停留在实验阶段，待解决的主要问题有：离子液体的阴阳离子组合设计与生物催化剂性能的匹配、离子液体的纯度与稳定性、离子液体的高效回收利用及降低成本等。

1.2.2 超临界流体

超临界流体是指温度和压力稍高于临界点时的一种特殊状态流体（如CO2在31℃和7.38MPa以上的状态），显示出了独特的性能：具有液体一样的密度、溶解能力和传热系数，具有气体一样的低黏度和高扩散系数。在临界状态附近，温度和压力的微小变化会导致溶质的溶解度发生几个数量级的突变，利用这一特性，超临界流体可以溶解、分离物质，成为很有潜力的一种绿色反应介质［18］。

Lozano等［18］在离子液体与超临界二氧化碳（scCO2）结合的介质中，研究了固定化脂肪酶催化合成环氧丙基酯的反应过程，这是因为离子液体能够保证酶的活性，scCO2能够很好的溶解、传递疏水性的底物。在35℃，7～18MPa条件下，即使底物浓度小也能够完成合成反应，而且在scCO2中的反应速率是有机溶剂中的2倍，同时scCO2添加到离子液体中，混合体系的黏性仅是同样条件下离子液体的1／5，显著提高了物质的传递速率。

超临界流体比较容易获得，能够溶解疏水和亲水的溶质，对于酶反应具有一定的优势，但目前更多的是借助分子动力学模拟进行分析。通过模拟无水scCO2和纯水中南极假丝酵母脂肪酶性能显示，脂肪酶在水中比在纯scCO2中更稳定，但是在scCO2中添加少量水，就会增加酶的稳定性。同时对离子液体－scCO2两相进行模拟，结果显示脂肪酶在两相中比在单纯的scCO2中更稳定［4］，这些结果仅仅是分子动力学模拟的分析，实际操作还不成熟，但是将酶－离子液体系统在scCO2中进行生物转化，过程更加干净，为绿色化学工业发展开辟了一条新路。

1.2.3 质子惰性的有机溶剂

质子惰性的有机溶剂是非水相生物催化研究中的一种新介质。Egusa等［19］在质子惰性的非水溶剂N，N－二甲基乙酰胺中，研究了壳二糖合成长链甲壳素的过程，用蔗糖油酸表面活性剂包埋溶菌酶，再用质子酸做辅助催化剂，得到了较高的催化效率（40%～80%）。

Egusa等［20］还通过N，N－二甲基乙酰胺表面活性剂包埋纤维素酶，很好地保护了酶的活性，同时添加质子酸做辅助催化剂，在质子惰性的有机溶剂中成功从纤维二糖中直接高效地合成长链纤维素，并且合成纤维的聚合度也达到了120，浓度比普通的无酸系统高出了5倍。

上述结果表明质子惰性的有机溶剂作为生物催化反应的介质是可行的，并且在大规模的低聚糖、多糖的合成上也是很有效率的，只是现在还不是很成熟，应用范围窄，需要进一步探索其在药物、精细化学品等合成方面的应用性能，以更广泛地应用于生物催化工程。

1.2.4 深低共熔溶剂

深低共熔溶剂［21］（DES）也是非水相生物催化中应用的一种新型绿色溶剂，是通过铵盐与氢键供体的结合形成的，熔点接近室温，具有低的挥发性和高的热稳定性，而且DES可生物分解，价廉易得，比多数离子液体具有明显优势。

Durand等［21］在深低共熔溶剂中，研究了固定化南极假丝酵母脂肪酶进行乙烯基酯的酯基转移反应，同时评价了不同链长度的醇类对底物极性的影响规律，结果显示固定化脂肪酶有更好的活性，并且深低共熔溶剂中的氢键供体组分能够和醇解反应竞争；同时研究了其他深低共熔溶剂在60℃生成正丁醇、正辛醇以及十八醇的浓度和选择性的对比，如摩尔比1∶2的胆碱氯化物与尿素、摩尔比1∶2的胆碱氯化物与甘油、摩尔比1∶1的胆碱氯化物与草酸、摩尔比1∶1的胆碱氯化物与丙二酸等，其中脂肪酶在摩尔比为1∶2的胆碱氯化物与甘油中表现出更高的活性和选择性，ee值可超过99%，这为脂肪酶催化提供了更多的选择。

相比传统的溶剂，深低共熔溶剂能很好保持酶的活性，但是在DES的具体例子中都是基于二羧基酸，其自身黏度就很高，随着反应进行黏度会逐渐增加，使得搅拌和回收都很困难，从而影响反应的进行及产物分离。

2 固定化载体

在非水相生物催化中，保持或增强酶和微生物的活性和稳定性是必须要考虑的方面，除了筛选极端微生物或通过定向进化等生物手段改造酶，固定化技术是一个简单易行且行之有效的工程手段。固定化技术的关键之一就是所用载体材料的性能，一般要求具有良好的传质性能、可保持酶或细胞的高活性、稳定性好、机械强度高、价格低廉、适合大规模工业生产等［22－24］。

常用的固定化载体可以分为无机载体（玻璃、硅凝胶、铝、斑脱土等）、高分子载体（天然高分子和合成高分子），近年来还出现了新型的无载体固定化技术。

2.1 无机载体

无机载体具有稳定性好、机械强度高、对微生物无毒性、不易被微生物所分解、耐酸碱、成本低、寿命长等优点，因而其应用日益增多。

Zhang等［25］通过吸附法将酿酒酵母脂肪酶固定在水化碳酸氢氧镁铝载体上，用于生物柴油的生产。结果显示，固定化脂肪酶活性在50℃时保留了95%，而游离酶是88%。从米根霉中提取的脂肪酶固定在CaCO3上，固定化的生物柴油产率在30min达到95%。但是吸附法的最大问题是容易造成酶的泄露及在溶剂中使用的活性损失［26］。可以看到，对于生物柴油生产，发展迅速的固定化技术满足了工业化需求，在不久的将来会替代化学催化。

Vila－Real等［27］将柚苷酶固定化在四甲氧基硅烷和甘油组成的溶胶－凝胶基质上，研究了柚苷水解为还原糖的反应。实验中选取了8种溶剂：二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、1，2－乙二醇二甲醚和1，4－二氧己烷，用来提高柚苷溶解性，并考察了柚苷酶的稳定性和活性，同时对α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶进行评价。结果表明，在有机溶剂或者共溶剂的存在下，固定化酶仍能保留50%的活性，并且稳定性也提高了；在水－四氢呋喃中，α－L－鼠李糖苷酶和β－D－葡萄糖苷酶的半衰期也分别增加了21倍和59倍。四甲氧基硅烷和甘油组成的溶胶－凝胶载体对于生物催化是一大创新，对将来更好地应用于生物催化显示了很大的优势。

近年来二氧化硅载体成为研究的热点。二氧化硅具有大比表面区域和可控制的孔径，而且能根据特定酶的尺寸进行调整，被广泛用于酶固定化的惰性载体［28］。Yu等［29］通过物理吸附、交联和共价结合三种方法，将玫瑰念珠菌脂肪酶固定在多孔二氧化硅载体上，研究了其在异辛烷溶剂中对共轭亚油酸和乙醇的选择性酯化作用。实验中的二氧化硅通过嵌段共聚物的非离子表面活性剂、氨基化和戊二醛嫁接进行修饰，固定的玫瑰念珠菌脂肪酶活性比游离酶高8倍，同时也展现了高水平的酯化活性和操作稳定性，并且在32h连续反应后总酯化作用的产率为43.2%～46.9%。共价结合法是表面功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，该方法与载体结合紧密，使用过程中不易脱落，但反应激烈、条件较难控制，往往容易造成活性损失，应用并不广泛。Cruz等［30］将南极假丝酵母脂肪酶用物理吸附法固定在二氧化硅纳米颗粒中，研究了己烷中进行的n－乙酰－L－苯丙氨酸乙酯的酯基转移反应，结果显示酶活性显著提高。

传统的无机载体材料价廉易得、机械强度高、无毒且稳定性好，一般是借助吸附法或经小分子化学改性以共价键合方式固定化酶，几乎不用于固定化细胞。但无机载体的结构不易调控，影响传质且键合酶的能力差，因此，通过对无机载体进行修饰或者与有机载体结合使用、制备兼具优良特性的载体成为今后研究的热点。

2.2 高分子载体

高分子载体既可用作酶的固定化，也可用于微生物细胞的固定化。固定化细胞是在固定化酶基础上逐步发展形成的，与酶固定化相比较，其具有以下优点：①无须进行酶的分离提取；②酶的稳定性高；③可进行细胞中多酶体系反应等。而且，固定化细胞具有密度大、可增殖、可实现反复使用、有利于产品的分离提取等特点，因此，固定化细胞技术在连续反应中占有明显的优势，主要被应用于工业、农业、医学、化学分析、环境保护、能源开发等领域［31］。高分子载体包括天然高分子和合成高分子［32］。

2.2.1 天然高分子载体

天然高分子材料的主要特点是来源广泛、无毒、有良好的传质性能。常见的天然高分子载体有海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、琼脂、卡拉胶、纤维素、明胶、胶原等，其中琼脂的机械强度较差［33］。另外，琼脂或者纤维素衍生物等可以形成油包水微乳液的有机凝胶，应用在不同种酶催化反应中，能够保留酶活性并且增加稳定性［34］。但是天然高分子材料也存在强度低、厌氧条件下易被微生物分解、使用寿命短等缺点，所以在实际应用中受到一定程度的限制。

Quiroga等［35］将酶包埋在海藻酸钙胶珠中，在4℃保存45天后，酶活性仍保留95%，20个水解反应周期后，活性维持在78%，固定化酶活性在缩氨酸的合成中比游离酶提高了26倍。这里用到的固定化方法是典型的包埋法［21］，是将细胞或酶包裹在凝胶网格结构或半透性聚合物薄膜内，小分子底物和产物可自由扩散，而细胞或酶不会扩散到周围的介质。

Garikipati等［36］利用海藻酸钙载体固定大肠杆菌，在乙酸月桂酸酯／水的两相体系中将萘转化为萘酚，但是实验中游离和固定化细胞损失60%，可能是有机溶剂的毒性造成的，但相比水相中而言，固定化细胞催化产物的产量提高了8倍。

张芳等［37］采用海藻酸钠载体固定化红酵母细胞，在水／有机溶剂两相体系中考察了3，5－双三氟甲基苯乙酮合成（S）－3，5－双三氟甲基苯乙醇的反应。结果表明，固定化红酵母细胞在5%辛烷中进行转化，于30℃、pH＝8、1142mg／mL底物浓度并添加葡萄糖作为辅助底物的条件下，转化效果最佳，经6次重复使用，仍可保留50%的转化活力。

尽管海藻酸钠具有良好的生物相容性，是目前在生物技术和医用组织工程等领域很有前景的生物材料，但在为数不多的非水相介质中应用时仍表现出机械强度差、溶剂相毒性和疏水物质传递难等问题，需要对其进行改性或与其他材料复合使用，以扩大它的应用。

Li等［38］研究了酵母酒精脱氢酶的固定化催化反应，将苯基乙醛酸催化形成苯乙醇酸，使用壳聚糖纳米微粒作为载体，用静电吸附和共价结合固定的方法，考察了固定化时间、酶浓度和pH值等条件，与游离酶比较，固定化酶保留原始活性的65%，显示了更显著的热稳定性和持久性。

韩鸿鹏等［39］选择琼脂、明胶、琼脂－明胶3类载体固定化放线菌2235产生的纤维素酶，分别以羧甲基纤维素钠（CMC－Na）和滤纸为底物，测定不同方法固定化纤维素酶的活性，确定用于固定化纤维素酶的优良载体。结果表明，明胶法固定化效果最差；琼脂－明胶协同法固定化效果最优，采用该方法测得的滤纸酶和CMC酶活性分别可达3317nkat·mL－1和8868nkat·mL－1。

2.2.2 合成高分子载体

合成高分子材料有较好的强度、较强的抵抗微生物分解性能，但是传质性能比较差。它可以用作任何一种酶的固定化载体，如果包埋细胞会使细胞的活性有一定程度的降低［40］。常见的合成高分子有聚丙烯酸（PAA）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺（PAM）、聚氨酯泡沫（PUF）等。

Yadav等［41］将脂肪酶固定在大孔聚丙烯酸树脂上，在甲苯溶剂中进行丁基－4－甲基－3－氧化戊酸酯的合成，结果显示，酯基转移率为87%，产物纯度达到98%，而且固定化酶是可以重复使用的。另外，他们还在微波照射的情况下，利用丙烯酸树脂固定化南极假丝酵母脂肪酶，进行（±）－1－（1－萘基）乙醇的动力学拆分研究，在60℃和30mg固定化酶用量下于n－正庚烷溶剂中反应3h，产物浓度达到47.74%，同时对映选择性为90.05%，实验结果与计算模拟一致，具有极大的工业应用前景［42］。

Pavlidis等［43］研究了水－离子液体微乳液基础的有机凝胶，这是一种新的固定化载体，当这种载体固定的酶被用在不同种类的极性和非极性的有机溶剂或者离子液体中时，酯化活性是油包水的微乳液有机凝胶固定化酶的44倍。这种固定化酶的活性在70℃仍保留几个小时，半衰期也比在水－油微乳液中高25倍。

Arabi等［44］分别用海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、聚乙烯醇为载体固定化念珠藻，在十六烷／水的催化体系中，将雄－4－3，17－二酮转化为睾酮，不同载体的产率分别为琼脂（25±18）%、卡拉胶（31±31）%、聚乙烯醇（36±6）%，而相比游离念珠藻（24±13）%的产率，海藻酸钠固定化细胞显示出更高的产率（72±23）%，比较可看出天然高分子载体的优势，而海藻酸钠是最突出的。

以上都是常用于非水相生物催化的高分子载体，它们的性能比较如表1所示［2］。

表1 常用高分子载体材料的性能比较

虽然整体上看合成高分子载体有一定的优势，但是传质性能差常导致反应效率低下及产物抑制等问题；天然高分子载体生物相容性好，对酶和细胞的毒性小，但需要进一步提高机械强度和在非水相介质中的适应性。

2.3 无载体固定化

无载体固定化技术是近年来发展起来的一种新型固定化方法。无载体酶固定化可能使用不同功能的交联剂，如利用戊二醛交联。另外，当一些酶在紧密靠近的时候，能够通过交联产生聚集体，如蛋白质晶体。

一方面，交联酶聚集体（CLEAs）有一定的优点：成本低、制备简单、具有高单位活性和操作稳定性、容易恢复和重新获得，同时在水相中是完全稳定的［45－46］。目前，CLEAs已经用于抗生素合成及化合物手性拆分等领域，表现出较好的催化活性和操作稳定性［47］。两种或多种不同类型酶（水解酶、氧化还原酶和裂解酶）的聚合和交联可以形成结合的CLEAs，适合利用多种酶的串联过程进行工业相关的生物转化，如将羟氰裂解酶、腈水解酶和酰胺酶构建成一个三层式立体交叉的结合－CLEA，置于反应器中成功实现苯甲醛到S－扁桃酸的一步转化过程［45］。

另一方面，虽然具有制备过程简单和催化性能优良的特点，但由于酶的种类、纯度和来源的差别，不同酶的CLEAs往往在制备及性质上存在差异，这就需要根据不同酶及所催化的反应特点来制备和使用CLEAs，才能将CLEAs技术应用于各类生物催化反应中。而且，在连续生物催化进程中，对于无载体的酶微粒，较差的机械强度和高压缩性是值得考虑的问题［48］。

Lai等［49］研究了青霉菌脂肪酶交联酶聚集体的催化性能并用于生物柴油的生产。实验考察了交联酶在水相、有机溶剂以及离子液体中的活性和稳定性，结果显示交联酶在有机溶剂中的半衰期比在水相中要高一些，并且在离子液体［Bmim］［PF6］中，青霉菌脂肪酶交联酶催化生产生物柴油的产率达到85.7%，从而表明青霉菌脂肪酶交联酶聚集体在生物柴油的工业生产中具有一定的应用潜力。

正是基于高活性保留和稳定性、高的催化生产力和产率，这种不需要载体的交联酶聚集体具有相当大的工业应用潜能。而且将这种酶固定在微通道反应器中可以实现快速筛选和最优化，并用于连续生产，这是生物催化技术的一大优势。交联酶聚集体技术的发展将更多地集中在制备机理的分析、微观结构的表征调控、与底物相互作用的研究以及应用体系的拓宽，并会与载体工程、溶剂工程等领域的新方法结合，以使其在生物催化和转化中发挥更大的优势［46］。

3 展 望

非水相生物催化技术具有提高疏水性底物和产物溶解性、降低产物抑制、抑制水解反应等优势，近年来在手性中间体及药物合成、精细化学品和生物能源生产等领域日益受到关注。目前，非水相生物催化技术的研究一方面集中在发现和筛选溶剂耐受性生物催化剂，利用合理设计及定向进化等技术改造酶以提高热稳定性或选择性；另一方面则致力于探索与构建生物相容且与生物催化剂性能匹配的非水相介质，而且实现了离子液体、超临界流体等新型介质中的生物催化过程，但是新型非水相介质要实现工业应用，还需达到规模化制备、性能稳定、可降解或易于回收、价格便宜以及适用范围广等要求。

固定化技术是传统水相生物催化过程中保持酶或微生物活性及稳定性的有效手段，而且能够解决生物催化剂长期操作稳定性差、难以回收再利用等问题，是工业应用环境中提高生物催化剂操作性能的一个相对简单的技术。近年来，固定化技术与非水相介质结合用于生物催化过程的报道日渐增多，在保持酶或微生物活性及稳定性、提高产率及调节反应选择性等方面都取得一定效果，但是，固定化载体制备条件的温和性、在非水相介质中的稳定性、底物和产物传质能力以及生物催化反应合成药物、手性中间体的区域选择性、立体选择性以及对映选择性等方面仍是需要努力的方向。

总之，非水相介质与固定化载体材料及方法的匹配与优化，并且选择合适的生物反应器结构和操作方式，才能更好的保证生物催化剂的活性和稳定性，实现高效的生物转化过程，推动非水相固定化生物催化在工业中的应用。

［1］ Gardossi L，Poulsen P B，Ballesteros A，et al.Guidelines for reporting of biocatalytic reactions［J］.Trendsin Biotechnology，2010，28（4）：171－180.

［2］ Yu H L，Ou L，Xu J H.New trends in non－aqueous biocatalysis［J］.CurrentOrganicChemistry，2010，14：1424－1432.

［3］ Sheldon R A.Reactions in non－conventional media for sustainable organic synthesis［J］.NewMethodologiesand TechniquesforaSustainableOrganicChemistry，2008，246：1－28.

［4］ Lousa D，Baptista A M，Soares C M.A molecular perspective on nonaqueous biocatalysis：Contributions from simulation studies［J］.PhysicalChemistryChemical Physics，2013，15：13723－13736.

［5］ Rico－Lattes I，Perez E，Franceschi－Messant S，et al.Organized molecular systems as reaction media［J］.ComptesRendusChimie，2011，14：700－715.

［6］ Kobayashi T.Lipase－catalyzed syntheses of sugar esters in non－aqueous media［J］.BiotechnologyLetters，2011，33：1911－1919.

［7］ Kansal H，Banerjee U C.Enhancing the biocatalytic potential of carbonyl reductase of Candida viswanathiiusing aqueous－organic solvent system ［J］.Bioresource Technology，2009，100：1041－1047.

［8］ Cheng C，Tsai H R J.Yeast－mediated enantioselective synthesis of chiralR－（＋）－andS－（－）－1－phenyl－1－butanol from prochiral phenylN－propyl ketone in hexane－water biphasic culture［J］.Chem.Technol.Biotechnol.，2008，83：1479－1485.

［9］ 侯丹丹，李会静，宋慧一，等.非水相体系中海藻酸钠－壳聚糖微胶囊粒径及强度性能［J］.化工学报，2012，63（5）：1522－1528.

［10］ Costas L，Bosio V E，Pandey A，et al.Effects of organic solvents on immobilized lipase in pectin microspheres［J］.AppliedBiochemistryandBiotechnology，2008，151（2－3）：578－586.

［11］ Kapoor M，Majumder A B，Mukherjee J，et al.Decarboxylativealdol reaction catalysed by lipases and a protease in organicco－solvent mixtures and nearly anhydrous organic solvent media［J］.BiocatalysisandBiotransformation，2012，30（4）：399－408.

［12］ Gorke J，Srienc F，Kazlauskas R.Toward advanced ionic liquids，polar，enzyme－friendly solvents for biocatalysis［J］.BiotechnologyandBioprocessEngineering，2010，15：40－53.

［13］ Zhao H.Methods for stabilizing and activating enzymes in ionic liquids－a review［J］.JournalofChemicalTechnology andBiotechnology，2010，85：891－907.

［14］ Maruyama T，Yamamura H，Kotani T.Poly（ethylene glycol）－lipase complexes that are highly active and enantioselective in ionic liquids［J］.Organic＆BiomolecularChemistry，2004，2：1239－1244.

［15］ Shah S，Solanki K，Gupta M N.Enhancement of lipase activity in non－aqueous media upon immobilization on multiwalled carbon nanotubes［J］.ChemistryCentralJournal，2007，1：1－6.

［16］ Hernández－Fernández F J，De los Ríos A P，Lozano－Blanco L J，et al.Biocatalytic ester synthesis in ionic liquid media［J］.JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology，2010，85：1423－1435.

［17］ 吴波，张玉梅，王华平.离子液体的安全性研究进展［J］.化工进展，2008，27（6）：814－818.

［18］ Lozano P，Diego T D.Synthesis of glycidyl esters catalyzed by lipases in ionic liquids and supercritical carbon dioxide［J］.JournalofMolecularCatalysisA：Chemical，2004，214：113－119.

［19］ Egusa S，Goto M，Kitaoka T.Facile and direct synthesis of long－chain chitin from chitobioseviaproton－assisted nonaqueous biocatalysis［J］.JournalofMolecular CatalysisB：Enzymatic，2013，87：69－74.

［20］ Egusa S，Goto M，Kitaoka T.One－step synthesis of cellulose from cellobioseviaprotic acid－assisted enzymatic dehydration in aprotic organic media［J］.Biomacromolecules，2012，13：2716－2722.

［21］ Durand E，Lecomte J，Baréa B，et al.Evaluation of deep eutectic solvents as new media forCandidaAntarcticaB lipase catalyzed reactions［J］.ProcessBiochemistry，2012，47：2081－2089.

［22］ 侯丹丹，于炜婷，戴小敏，等.非水相细胞催化研究进展［J］.化工进展，2011，30（4）：830－837.

［23］ Sheldon R A，Pelt S V.Enzyme immobilisation in biocatalysis：Why，what and how［J］.ChemicalSociety Reviews，2013，42：6223－6235.

［24］ DiCosimo R，McAuliffe J，Poulose A J，et al.Industrial use of immobilized enzymes［J］.ChemicalSocietyReviews，2013，42（6）：437－6474.

［25］ Zhang B H，Weng Y Q，Xu H，et al.Enzyme immobilization for biodiesel production［J］.Applied MicrobiologyandBiotechnology，2012，93：61－70.

［26］ Brady D，Jordaan J.Advances in enzyme immobilization［J］.BiotechnologyLetters，2009，31：1639－1650.

［27］ Vila－Real H，Alfaia A J，Calado A R.Improvement of activity and stability of soluble and sol－gel immobilized naringinase inco－solvent systems［J］.Journalof MolecularCatalysisB：Enzymatic，2010，65：91－101.

［28］ Betancor L，Luckarift H R.Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis［J］.Trendsin Biotechnology，2008，26（10）：566－572.

［29］ Yu W H，Fang M，Tong D S，et al.Immobilization of Candida rugosa lipase on hexagonal mesoporoussilicas and selective esterification in nonaqueous media［J］.BiochemicalEngineeringJournal，2013，70：97－105.

［30］ Cruz J C，Wurges K，Kramer M，et al.Immobilization of enzymes on fumed silica nanoparticles for applications in nonaqueous media［J］.NanoscaleBiocatalysisMethodsin MolecularBiology，2011，743：147－160.

［31］ 石小霞，褚可成，陈志梅，等.固定化细胞技术及其应用［J］.食品工业科技，2010，12：380－385.

［32］ Yu W T，Lin J Z，Liu X D，et al.Quantitative characterization of membrane formation process of alginatechitosan microcapsules by GPC［J］.JournalofMembrane Science，2010，346：296－301.

［33］ 陈娜丽，冯辉霞，王冰，等.固定化细胞载体材料的研究进展［J］.化学与生物工程，2009，26（10）：13－17.

［34］ Zoumpanioti M，Stamatis H，Xenakis A.Microemulsionbased organogels as matrices for lipase immobilization［J］.BiotechnologyAdvances，2010，28：395－406.

［35］ Quiroga E，Illanes C O，Ochoa N A，et al.Performance improvement of araujiain，a cysteine phytoprotease，by immobilization within calcium alginate beads［J］.Process Biochemistry，2011，46：1029－1034.

［36］ Garikipati S V B J，McIver A M，Peeples T L.Whole－cell biocatalysis for 1－naphthol production in liquid－liquid biphasic systems［J］.AppliedandEnvironmental Microbiology，2009，75（20）：6545－6452.

［37］ 张芳，薛颖，李莉，等.两相体系中固定化酵母细胞催化3，5－双三氟甲基酮的不对称还原［J］.药物生物技术，2010，17（2）：125－129.

［38］ Li G Y，Zhou Z D，Li Y J，et al.Surface functionalization of chitosan－coated magnetic nanoparticles for covalent immobilization of yeast alcohol dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae［J］.JournalofMagnetismand MagneticMaterials，2010，322：3862－3868.

［39］ 韩鸿鹏，郝青梅，张丽琴，等.放线菌产纤维素酶固定化研究［J］.生态与农村环境学报，2011，27（6）：109－113.

［40］ 渠文霞，岳宣峰.细胞固定化技术及其研究进展［J］.陕西农业科学，2007（6）：121－123.

［41］ Yadav G D，Shinde S D.Kinetic modeling and optimization of immobilized Candida antarcticalipase B catalysed synthesis of butyl－4－methyl－3－oxopentanoate using response surface methodology［J］.ChemicalReactorEngineering，2012，10：1－21.

［42］ Yadav G D，Devendran S.Lipase catalyzed kinetic resolution of（±）－1－（1－naphthyl）ethanol under microwave irradiation［J］.JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2012，81：58－65.

［43］ Pavlidis I V，Tzafestas K，Stamatis H.Water－in－ionic liquid microemulsion－based organogels as novel matrices for enzyme immobilization［J］.BiotechnologyJournal，2010，5（8）：805－812.

［44］ Arabi H，Yazdi M T，Faramarzi M A.Influence of whole microalgal cell immobilization and organic solvent on the bioconversion of androst－4－en－3，17－dione to testosterone by Nostocmuscorum［J］.JournalofMolecularCatalysisB：Enzymatic，2010，62：213－217.

［45］ Sheldon R A.Cross－linked enzyme aggregates as industrial biocatalysts［J］.OrganicProcessResearch＆Development，2011，15（1）：213－223.

［46］ 王梦凡，齐崴，苏荣欣，等.交联酶聚体技术研究进展［J］.化学进展，2010，22（1）：173－179.

［47］ Wang M F，Qi W，Su R X，et al.Preparation and properties of cross－linked enzyme aggregates of papain［J］.ChemicalJournalofChineseUniversities，2010，31（9）：1774－1779.

［48］ Roessl U，Nahalka J，Nidetzky B.Carrier－free immobilized enzymes for biocatalysis［J］.Biotecheology Letters，2010，32（3）：341－350.

［49］ Lai J Q，Hu Z L.Catalytic performance of cross－linked enzyme aggregates of penicilliumexpansum lipase and their use as catalyst for biodiesel production［J］.Process Biochemistry，2012，47：2058－2063.