苹果脱毒技术研究进展

胡国君， 董雅凤， 张尊平， 范旭东， 任 芳， 朱红娟

(中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心，兴城 125100)

苹果脱毒技术研究进展

胡国君， 董雅凤*， 张尊平， 范旭东， 任 芳， 朱红娟

(中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心，兴城 125100)

苹果(MaluspumilaMill.)普遍感染病毒。目前，培育无病毒原种母本树，建立用于繁殖接穗和营养系砧木的母本园，栽植无病毒苗木，是防治病毒病的根本措施。本文针对常见的4 种苹果病毒及1 种类病毒，综述了茎尖培养、热处理、化学处理、微茎尖嫁接以及低温处理脱除苹果病毒方法的研究进展，分析了不同方法的应用效果，及所适合脱除的病毒种类，以期为我国苹果病毒脱除技术研究提供参考信息。

苹果； 病毒； 脱除

苹果(MaluspumilaMill.)是世界范围内广泛种植的果树，研究表明，我国栽植的苹果普遍感染多种病毒[1-2]。苹果花叶病毒(Applemosaicvirus, ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus, ACLSV)、苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus, ASPV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus, ASGV)是侵染苹果的最常见病毒[3]。ApMV隶属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳定环斑病毒属(Ilarvirus)，是苹果上的重要病毒，苹果感病后在叶片上出现大小不一的鲜黄色或黄白色斑块，形成花叶，还可能出现沿叶脉褪绿黄化的网纹型症状[4-5]。ACLSV、ASGV和ASPV分别隶属β线形病毒科(Betaflexiviridae)的纤毛病毒属(Trichovirus)、发线病毒属(Capillovirus)和凹陷病毒属(Foveavirus)[6]，3 种病毒在多数苹果栽培品种中呈潜隐性，不表现症状，只在少数感病品种或指示植物上表现症状[1]。ACLSV可引起‘俄罗斯小苹果’畸形，叶片变小，褪绿斑和线纹等症状[7]。ASGV可引起木本指示植物‘弗吉尼亚小苹果’产生茎沟槽、嫁接口肿大、不亲和等典型症状[8]。ASPV可引起‘光辉’苹果植株矮小、叶片反卷，以及‘Spy 227’长势衰弱[9]。此外，苹果上还有一种重要的类病毒，苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid, ASSVd)，可引起苹果的锈果病。1934年，锈果病在我国苹果中首次发现，给我国苹果产业造成了严重损失，20世纪50年代，辽宁省有数以万计的苹果树感染了该病害[10-12]。

在我国苹果主要栽培区，上述3 种苹果潜隐病毒的带毒株率高达80% ～ 100%[1]，每年使苹果减产约17% ～ 40%[3]。带病毒和无病毒树对比试验结果显示，感病后苹果果实畸形、变小、着色不良、风味淡、不耐贮藏，商品果率下降16.9% ～ 60.0%；果实内可溶性固形物、总糖、还原糖及Ca、Fe、Mn 含量下降，果肉硬度降低；树体内含物质GA3、CTK、IAA、RNA 和蛋白质含量降低，DNA含量升高；总光合强度及净光合强度下降，呼吸强度升高；叶片变小、畸形、失绿，营养生长受阻；树高、干径、冠径和一年生枝长势减弱，坐果率和产量降低，总生长量减少16% ～ 40%。如果土壤贫瘠、水肥欠缺、管理不善或利用了对病毒较敏感的砧木和品种时，会使植株衰弱死亡，造成果园残缺不全，甚至全园毁灭[13-15]。苹果病毒主要通过嫁接传染，随带毒繁殖材料(如苗木、接穗、营养系砧木等)远距离传播扩散，迄今尚未发现任何传毒介体。苹果一旦感染病毒，就很难防治。目前，采用脱毒技术，培育无病毒原种，建立用于繁殖接穗和营养系砧木的母本园，栽植无病毒苗木，加强病毒检疫，是防治病毒病的根本措施[16-17]。本文针对常见的苹果病毒，综述了茎尖培养、热处理、化学处理、微茎尖嫁接等苹果病毒脱除方法的研究进展，以期为我国苹果病毒脱除技术研究提供参考信息。

1 微茎尖嫁接(shoot-tip micrografting)

随着嫁接材料和方式的不断改进，发展出了微茎尖嫁接技术，主要是将微小的茎尖嫁接到砧木上[18-20]。White[21]在20 世纪30 年代初提出，病毒在植物体内的分布不均一, 植物顶端分生组织几乎没有病毒。之后，微茎尖嫁接技术在病毒的脱除研究中得到应用[22]。柑橘是最早通过该技术获得无病毒植株的树种[23]。20 世纪80 年代，获得了苹果的无毒植株[24]。研究表明，接穗的大小与病毒的脱除率成反比，与嫁接成活率成正比，一般离体接穗大小为含2个叶原基的茎尖[24]。

2 茎尖培养(shoot tip culture)

植物茎尖处存在一个直径为0.1 mm，长为0.25 mm的无毒区，此外，愈伤组织中也存在大量的健康细胞，这是进行茎尖培养脱毒的依据[25-26]。人们最初认为茎尖不含病毒是因为顶端分生组织分化速度快、生长旺，且不含维管束，病毒很难到达[27]。现在有研究认为，茎尖无毒区的存在可能是由于病毒在具有分生能力的茎尖细胞中发生了RNA沉默[28]。脱毒过程中，茎尖培养脱毒效果的高低，主要取决于切取的茎尖大小，茎尖大于0.2 mm难以脱除病毒。

通常，单独茎尖培养的脱毒效率较低，王焕玉等[16]采用茎尖培养的方法进行苹果病毒的脱除研究，茎尖的大小为0.1～0.2 mm，虽然获得了‘千秋’和‘长富’2个品种的无毒植株，但平均脱毒率只有30%。然而，茎尖培养对脱除ApMV的效果较好，Plopa和Preda[29]切取1 mm茎尖能获得无ApMV的再生植株，‘金冠’、‘兰蓬王’和‘Golden Spur’3 个品种的ApMV脱除率分别为 83%、80%和77%，此外，根尖(0.3 mm)培养也能获得无毒的再生植株，3 个品种的脱毒率为50% ～ 58%。

3 热处理脱毒(thermotherapy)

病毒在植株中的浓度代表复制和降解的平衡，而升高温度可以促进寄主对病毒的降解。自Kunkel[30]发现34.4 ℃和36.3 ℃对桃树的黄化病和丛枝病有抑制作用后，采用高温进行病毒脱除的技术逐渐被建立起来。热处理脱毒主要是依据病毒和寄主细胞对高温忍耐性不同，选择适当的温度和处理时间，可抑制病毒繁殖、延缓其扩散速度，使寄主细胞的生长速度超过病毒扩散速度，从而在这一高温下长出的新植株、器官或组织都有可能不带有病毒[31]。关于热处理脱毒的机理还不是很明确，最初，人们普遍认为病毒的钝化温度是高温能够脱除病毒的主要原因，后来，也有研究表明高温与植物体内的防御酶关系密切[32]。最近，一些学者在研究温度与症状表现的关系时发现，在高温条件下病毒产生的siRNA量急剧增加，所以推测热处理脱毒可能与RNA沉默有关[33]。最初的热处理脱毒是将感病植株悬挂在热处理箱上进行高温处理。一般来说，热处理的温度越高，脱毒率越高，但是苗木的死亡率也高。在苹果的热处理脱毒研究中，根据处理材料不同，可分为盆栽苗热处理和试管苗热处理，处理完成后一般进行嫩梢嫁接或茎尖培养。

3.1 试管苗热处理

主要是指将离体的苹果试管苗在高温条件下进行热处理。处理结束后，切取一定大小的茎尖再进行组织培养，获得再生植株。

一般采用37～39 ℃的高温，处理20～30 d，然后切取0.3～1 mm的茎尖，就可获得无毒的苹果再生植株[4, 15, 34]。苏佳明等[35]将‘红将军’苹果的试管苗在38 ℃高温条件下恒定热处理20 d， ASGV、ASPV、ApMV和ACLSV 等病毒的脱毒率达86.4%～100%。根据处理温度的不同，试管苗热处理可分为恒温和变温两种形式，恒温热处理的病毒脱除率相对高，但是死亡率也较高，变温热处理脱除率相对较低，但有利于延长苗木在处理期间的寿命[36]。程玉琴等[36]恒温38 ℃处理苹果品种‘小金海棠’20 d，ACLSV和ASGV的脱除率分别为86.7%和73.3%；而变温38 ℃/22 ℃处理30 d，两种病毒的脱除率分别为73.3%和60.0%。不同苹果品种的耐热性不同，脱除率也存在差异，研究表明，恒温39 ℃处理6 d可完全脱除苹果品种‘Idared’中的病毒，但对‘Sampion’中的病毒几乎未产生作用[37]。当茎尖在一定长度范围内(约1 mm)时，茎尖成活率与试材、热处理方式、处理时间等无明显关系, 而与培养温度等外界条件的关系密切[38]。

3.2 盆栽苗热处理

主要是指将盆栽的苹果苗在高温条件下进行热处理。一般处理结束后，切取一定大小的嫩梢(1～2 cm)进行嫁接，或是切取一定大小的茎尖(1～2 mm)进行组织培养。

研究表明，盆栽苗经热处理后，病毒症状将明显减弱。Welsh和Nyland[39]将盆栽的苹果植株先在35 ℃处理7 d，再在38 ℃条件下处理7 d，然后将芽嫁接到新的砧木上，可抑制‘弗吉尼亚小苹果’上的茎痘、‘Spy 227’的树皮坏死、‘兰蓬王’苹果上的木质部胶化以及‘海棠’子叶和茎尖上的症状。通过比较发现，热处理后茎尖培养的病毒脱除率高于嫩梢嫁接的脱毒率。王焕玉等[16]将‘金冠’、‘红星’和‘国光’3 个苹果品种的盆栽苗在(37 ± 1) ℃条件下恒温热处理，15～28 d后切取1.0～1.5 cm嫩梢嫁接到实生砧木上，成活植株中3 种潜隐病毒的脱除率为27%～45%；而同样的热处理条件下，茎尖培养再生植株的脱毒率可达100.0%[40-41]。除潜隐病毒外，盆栽苗热处理对ApMV的脱除效果也较好，Bhardwaj等[42]研究表明，37 ℃处理4周或是40 ℃处理2 周即可完全脱除苹果上的ApMV。

4 化学处理(chemotherapy)

植物的抗病毒基因与抗其他病原菌的基因不同，不是由单一的显性性状控制，不能被优先遗传，因此，一般化学防治所用的化学试剂不能控制病毒病害[43]。目前，从病毒的吸附、渗透、脱衣壳到核酸复制和蛋白质合成的各个环节都有相应的病毒抑制剂[44]。植物病毒的抑制剂包括天然的抗病毒物质及核酸类似物。黄酮(flavonoids)是一种广泛存在于植物内的具有抗病毒活性的物质，主要通过抑制cAMP 磷酸二酯酶的活性来促进cAMP的合成，从而抑制病毒的复制[45]。桑色素(morin，3, 5, 7, 2′, 3′-五羟基黄酮)、槲皮素(quercetin，3, 5, 7, 3′, 4′-五羟基黄酮)、7, 4′-di-O-苄槲皮素和商陆素(ombuin)，7, 4′-二甲基槲皮素等都属于黄酮类[46]。甘草酸(glycyrrhizin)也是一种天然的病毒抑制剂，其作用机制还不是很明确[47]。James等[48]选用多种病毒抑制剂来脱除苹果上的ASGV，结果表明，黄酮类似物中只有商陆素可抑制ASGV，桑色素、槲皮素和7, 4′-di-O-苄槲皮素单独使用都对ASGV没有作用，但如果将槲皮素与甘草酸等混合使用可抑制ASGV的复制。此外，James等[49]通过跟踪发现，经化学试剂处理后获得的无毒苹果植株，生长11 年后仍检测不到病毒的存在。

常用于苹果病毒脱除的抗病毒剂还包括2′, 4′, 4′-三羟基查耳酮、2, 4-二羰基六氢-1, 3, 5-三嗪 (DHT) 和病毒醚(ribavirin)等核酸类似物。其中，病毒醚应用最为广泛，其作用机理主要是抑制病毒mRNA的加帽和延伸，尤其是阻止鸟嘌呤核苷5′磷酸的合成，以及阻止已合成的mRNA帽子结构的甲基化反应，从而抑制病毒核酸的合成[50-51]。采用病毒醚处理已获得多个苹果品种的无病毒植株[48, 52-55]。研究表明，当病毒醚的浓度高于40 mg/L时，寄主将产生严重的药害[52-54, 56]，但药害的产生与品种及品种的基因型关系密切，有些品种在病毒醚浓度很高(≥100 mg/L)时，仍不产生药害[55]。

5 热处理结合化学处理(thermotherapy combined with chemotherapy)

6 低温处理(cold therapy)

热处理可脱除ApMV、ACLSV、ASGV和ASPV等多种病毒，但对ASSVd的脱除率只有20% ～ 60%，有些品种甚至不足6%[60-61]。后来，人们发现，较低的温度可以抑制或停止类病毒的复制和移动，其机理尚不清楚[62]。采用低温处理脱除类病毒的温度一般为4～10 ℃，目前已经脱除了马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)、菊花矮小类病毒(CSV)和啤酒花矮化类病毒(HSVd)等类病毒[63-65]。此外，也有研究将热处理和低温处理可结合起来进行脱毒处理。Desvignes等[61]将处理植株先在4～5 ℃条件下处理3个月，然后再进行恒温(36～ 37 ℃)热处理，嫁接成活的植株中ASSVd的脱除率达88.4%。

7 结论与展望

病毒的脱除效果不仅与病毒的种类和含量、栽培品种的基因型以及采用的脱除方法有关，还受试验条件以及试验完成情况的影响[66-68]。此外，研究还发现，脱毒率与病毒的组成关系密切，复合感染的病毒较单一感染的病毒难于脱除[37, 69]。其中，热处理的应用广泛，形式多样，常见的处理方式为热处理结合茎尖培养[32-38]。热处理过程中，由于品种间的耐热性不同，致使同种病毒的脱除效果不同，此外，处理温度和处理时间也与寄主的耐热性有关[15, 36-37, 70]。进行化学处理时，处理时间相对较长，其脱除率不仅与病毒和寄主的种类等因素有关，还与选用的化学试剂浓度有关[48, 50-56]。微茎尖嫁接由于受技术条件影响，在苹果病毒的脱除中应用相对较少[24]，低温处理主要针对ASSVd的脱除[61]。

常见的苹果病毒及类病毒中，ApMV最容易脱除，早在1959年，Hunter便采用热处理的方法脱除了该病毒，茎尖培养也很容易脱除ApMV[29-30]；3种潜隐病毒中，ACLSV的脱除较为容易，其次为ASPV，通过短期的热处理或是茎尖培养便能脱除，ASGV的耐受性很强，热处理和茎尖培养的方法很难脱除[36-40]，而病毒醚等抗病毒剂能很好地抑制该病毒的复制[48-49, 55]；此外，低温处理能较好地脱除类病毒ASSVd[61]。

我国是世界第一大苹果生产国，栽培面积已达222 万hm2，年产量达3370 万t，培育和栽植无病毒苗木是控制苹果病毒病传播、蔓延和危害的最经济有效措施[71]。脱毒处理作为控制苹果病毒最为行之有效的方法，越来越被人们所认识。在苹果的脱毒研究中，要综合考虑处理的品种、感染病毒的种类等多种因素，制定出合理的实施方案，选用适宜的脱毒方法。

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Researchprogressinviruseliminationtechniquesforappletrees

Hu Guojun, Dong Yafeng, Zhang Zunping, Fan Xudong, Ren Fang, Zhu Hongjuan

(NationalCenterforEliminatingVirusesfromDeciduousFruitTree，ResearchInstituteofPomology，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Xingcheng125100，China)

Apple(MaluspumilaMill.) is affected by many viral diseases. The major measure for controlling apple virus diseases is eliminating virus from mother trees, constructing parent plants for reproducing scion and stock materials and planting virus-free seedlings. Four kinds of viruses and one kind of viroid commonly occurred in apple trees. This review summarized the measures applied for apple virus elimination,e.g. shoot tip culture, thermotherapy, chemotherapy, shoot-tip micrografting and cold therapy, and analyzed the application efficiency and different approaches for different virus types. It will help the future research in the field of virus elimination from apple trees.

apple; viruses; elimination

2014-03-24

：2014-04-26

公益性行业(农业)科研专项(201203076)

S 436.611

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.002

* 通信作者 Tel: 0429-3598278；E-mail: yfdong@163.com