白头翁叶斑病菌黑色素的理化性质及其生物合成途径初步研究

苏 丹， 吕国忠， 周如军， 杨 红， 傅俊范*

(1. 大连民族学院环境与资源学院, 大连 116600; 2. 沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)

白头翁叶斑病菌黑色素的理化性质及其生物合成途径初步研究

苏 丹1， 吕国忠1， 周如军2， 杨 红1， 傅俊范2*

(1. 大连民族学院环境与资源学院, 大连 116600; 2. 沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)

对白头翁叶斑病菌胞壁结合黑色素和胞外黑色素进行了理化性质和红外光谱扫描测定，结果表明两者具有相似的理化性质，均易溶于KOH、H2O2和NaClO，不溶于水、乙醇和丙酮。红外光谱分析表明，白头翁叶斑病菌YS-24菌株的胞壁结合黑色素与胞外黑色素为同一种类型的黑色素。DHN黑色素的特异性抑制剂—三环唑，对白头翁叶斑病菌黑色素的产生有明显的抑制作用；以白头翁叶斑病菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增，得到了聚酮体合成酶基因的同源片段AaPKS，初步推断白头翁叶斑病菌黑色素合成属于DHN途径。

白头翁叶斑病菌； 黑色素； 红外光谱扫描； DHN途径

白头翁(Pulsatillachinensis)为毛茛科白头翁属多年生草本植物，其根可入药[1]。白头翁作为中药始载于《神农本草经》，其性寒，味苦，具有凉血止痢、燥湿杀虫的功效[2]，药理研究表明其有抗微生物、抗蔗糖酶、抗肿瘤等活性[3]。白头翁叶斑病(windflower leaf spot)由银莲花壳二孢(Ascochytaanemones)引起，是目前影响白头翁生产最为严重的病害之一，在白头翁整个生育期中只要温度、湿度适宜，其叶片、叶柄、茎均可受到感染发病，病田率可高达100%[4]。

黑色素(melanin)是一种广泛存在于动植物及微生物中的无定形小颗粒状的类多酚聚合体，按其合成途径的不同可分为 γ-谷氨酰胺酰-3,4-对苯二酚(GHB)、儿茶酚、多巴(DOPA)和多聚二羟萘(DHN)4 种。目前报道较多的是DOPA和DHN，且两者存在相似的理化性质，其中DHN黑色素普遍存在于半知菌和子囊菌等真菌中[5]。对许多植物病原真菌而言，DHN黑色素被认为是重要的毒力因子，对病原物—寄主互作产生影响[6]。

聚酮体合成酶作为DHN黑色素合成第一步的催化酶发挥着非常重要的作用，Moriwaki等从稻平脐蠕孢(Bipolarisoryzae)中分离得到一个合成黑色素必需的聚酮体合成酶基因PKS1，发现近紫外线(300～400 nm)照射会加强其表达[8]；另外，从Ascochytarabiei中分离到的ArPKS1基因参与合成黑色素，ArPKS1缺失突变体的分生孢子器对紫外线表现出很强的敏感性[9]，本研究利用PCR扩增技术得到了白头翁叶斑病菌PKS基因的同源片段，并定名为AaPKS基因。

杀真菌剂三环唑(tricyclazole)是DHN黑色素合成的特异性抑制剂，能够抑制DHN黑色素合成过程中的两步脱氢反应(1, 3, 6, 8-四羟基萘还原为小柱孢酮scytalone；1, 3, 8-三羟基萘还原为柱孢醌vermelone)，导致真菌黑色素合成受阻，产生的色素由黑褐色变成红棕色。例如，三环唑能够有效抑制稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、瓜类炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)等多种真菌黑色素的生物合成[10]。笔者对白头翁叶斑病菌黑色素的理化性质及生物合成途径进行了研究，为其致病机理的深入研究及新型杀真菌剂的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：白头翁叶斑病菌(A.anemones)菌株YS-24，由沈阳农业大学药用植物病害研究室分离鉴定并保存。

供试培养基：PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，水1 000 mL)和PD培养液(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)。

供试药剂：三环唑(纯度达98%以上)由大连瑞泽农药股份有限公司生产。

供试试剂：标准品DOPA黑色素，购于Sigma公司。

1.2 白头翁叶斑病菌黑色素的制备与纯化

1.2.1 胞壁结合黑色素的提取

参照苹果黑星病菌黑色素的提取方法[11]，提取白头翁叶斑病菌细胞壁中的黑色素。

1.2.2 胞外黑色素的提取

将菌株YS-24接种于装有150 mL PD培养液的三角瓶中，25 ℃黑暗静置培养30 d。培养结束后离心得上清液，滤液用7 mol/L HCl调至pH 2.0～3.0，静置24 h后，10 000 r/min离心20 min，沉淀为胞外黑色素粗提物。

1.2.3 白头翁叶斑病菌黑色素的纯化

将黑色素粗提物与7 mol/L HCl充分混匀，沸水浴2 h，12 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mol/L KOH溶解，再用7 mol/L HCl调溶液至pH 2.0，12 000 r/min离心10 min，按照上述步骤重复3次，沉淀用0.01 mol/L HCl、蒸馏水依次洗涤，1 000 r/min离心20 min，所得沉淀55 ℃烘干至恒重，干燥器内干燥24 h后，-20 ℃保存。

1.3 白头翁叶斑病菌黑色素理化性质测定

参照玉米大斑病菌黑色素理化性质的测定方法[12]，测定白头翁叶斑病菌黑色素和标准品黑色素的理化性质。

1.4 黑色素红外光吸收光谱分析

称取纯化后的黑色素样品2 mg与500 mg干燥的KBr混匀，在玛瑙研钵中进行研磨，用YP-2压片机压片后，在PerkinElmer Spectrum 65傅立叶红外光谱仪上400～4 000 cm-1区间进行红外光谱扫描，并与标准品DOPA黑色素的红外吸收光谱进行比较分析。

1.5 三环唑对白头翁叶斑病菌黑色素产生的影响

称取纯品三环唑添加至150 mL PDA 培养基中，至终浓度分别为10、25、50、100 μg/mL。接入经活化的白头翁叶斑病菌YS-24菌饼，置于25 ℃恒温培养箱中，以不添加三环唑的培养基为空白对照，10 d后观察并测量各处理菌落生长情况。

1.6 白头翁叶斑病菌聚酮合成酶PKS基因同源片段的扩增

利用DNAMAN软件，根据已知的构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、展青霉(Penicilliumpatulum)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等病原真菌PKS基因序列的保守区域设计引物PKS3:5′-GATGCCAAAGAAAGCTGGTC-3′和PKS4:5′-CATGGCGCAGACATTAAGA-3′，扩增白头翁叶斑病菌的PKS基因。

2 结果与分析

2.1 白头翁叶斑病菌黑色素理化性质研究

白头翁叶斑病菌胞内、胞外黑色素均与标准品黑色素理化性质相似。它们均溶于1 mol/L KOH(100 ℃)、30% H2O2和3.5% NaClO，而不溶于水、有机溶剂乙醇和丙酮。

表1 白头翁叶斑病菌黑色素理化性质1)Table 1 Physicochemical property of melaninproduced by A.anemones

1) “+”表示反应；“-”表示不反应。 “+”reactive；“-”unreactive.

2.2 白头翁叶斑病菌黑色素红外光谱分析

由红外光谱图(图1a～b)可知，白头翁叶斑病菌菌株YS-24的胞壁结合黑色素和胞外黑色素红外光谱图一致，说明胞内黑色素和胞外黑色素为同一种类型的黑色素。

白头翁叶斑病菌黑色素红外光谱中：2 900～2 930 cm-1处强吸收峰和2 820～2 860 cm-1处强吸收峰为脂肪族C-H伸缩振动峰，1 600～1 630 cm-1的较强吸收峰为C=O峰，与文献报道的苹果黑星病菌(Venturiainaequalis)中的DHN黑色素吸收峰一致[11]；而标准品DOPA黑色素的红外光谱中(图1c)，3 300～3 400 cm-1处有较宽吸收峰，由NH2中的N-H的伸缩振动产生，1 590～1 610 cm-1附近强吸收峰，为C=C伸缩振动峰(DOPA黑色素特征吸收峰)，白头翁叶斑病菌黑色素缺少该峰，由以上结果可知，白头翁叶斑病菌产生的胞壁黑色素和胞外黑色素与DHN黑色素相似，不同于DOPA黑色素。

2.3 三环唑对白头翁叶斑病菌黑色素产生的影响

三环唑为DHN黑色素合成的特异性抑制剂。不添加三环唑培养的白头翁叶斑病菌菌落呈黑褐色，分生孢子细胞壁中沉积一层电子密度较高的黑色素。而三环唑在浓度10～100 μg/mL范围内均能抑制白头翁叶斑病菌黑色素的产生，浓度仅为10 μg/mL时，即可使菌落颜色发生变化，菌落呈现红棕色(图2)，说明该病菌对三环唑十分敏感。由此可以推断白头翁叶斑病菌黑色素合成主要是通过DHN途径来实现的。

图1 白头翁叶斑病菌黑色素与DOPA黑色素的红外扫描光谱Fig.1 Infrared spectra of A.anemones melanin and DOPA melanin

2.4 白头翁叶斑病菌聚酮体合成酶PKS基因同源片段的克隆

利用特异性引物PKS3和PKS4对白头翁叶斑病菌YS-24基因组DNA进行PCR扩增，获得1条3 000 bp左右的条带(图3)，回收测序得到长度为3 503 bp的序列，与预测片段大小一致,定名为AaPKS。经NCBI网站nucleotide BLAST比对，证实此片段与蚕豆壳二孢(A.fabae，GenBank登录号为GQ150544)和鹰嘴豆壳二孢(A.rabiei，GenBank登录号为GQ150552)的PKS基因核苷酸序列具有高度的同源性，分别为88%和86%，进一步说明了白头翁叶斑病菌黑色素合成属于DHN途径。

图2 三环唑对白头翁叶斑病菌黑色素产生的影响Fig.2 Effects of tricyclazole on melanin production of A.anemones

图3 白头翁叶斑病菌聚酮体合成酶PKS基因同源片段扩增结果Fig.3 PCR amplification of AaPKS homologousgene of A.anemones

3 结论与讨论

黑色素在动物、植物和微生物中广泛存在，不同生物体内的黑色素具有不同的种类和功能[13]。黑色素不仅可以提高真菌在一定环境下的生存和竞争能力，而且还是一些植物病原真菌重要的致病因子。因此，明确白头翁叶斑病菌黑色素的种类及其生物合成途径，利于有效防治白头翁叶斑病的发生。本研究对白头翁叶斑病菌黑色素的理化性质进行了分析，明确了其具有一般黑色素的共同特性[14]；红外光谱分析表明，白头翁叶斑病菌胞壁结合黑色素和胞内黑色素为同一类型的黑色素，具有DHN黑色素的特征吸收峰，不同于DOPA黑色素。一些植物病原真菌，如水稻稻瘟病菌(M.grisea)、禾谷炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola)、葫芦刺盘孢菌(Colletotrichumlagenarium)均含有DHN黑色素[15]，且被认为是重要的毒力因子，白头翁叶斑病菌DHN黑色素是否与病原菌致病性相关有待进一步研究。

三环唑在浓度为10～100 μg/mL时均能抑制白头翁叶斑病菌黑色素产生，浓度仅为10 μg/mL即可使菌落颜色发生变化，说明该病菌对三环唑十分敏感，这与玉米大斑病菌对三环唑的敏感性十分相似[5]。

本文结合白头翁叶斑病菌的红外光谱特征、白头翁叶斑病菌对三环唑的敏感程度以及AaPKS基因的获得，初步断定白头翁叶斑病菌黑色素合成为DHN合成途径。今后将进一步对AaPKS基因的功能进行深入研究，明确该基因在白头翁叶斑病菌黑色素合成途径中的作用，为白头翁叶斑病菌的致病机制研究提供理论依据。

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CharacteristicsandbiosyntheticpathwayofmelanininAscochytaanemones

Su Dan1, Lü Guozhong1, Zhou Rujun2, Yang Hong1, Fu Junfan2

(1.CollegeofEnvironmentandResources,DalianNationalitiesUniversity,Dalian116600,China;2.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

The characteristics of melanin, extracted from cell wall and fermented filtrate ofAscochytaanemones, were determined by diagnostic test and infrared spectroscopy. The results indicated that they have similar physical and chemical properties, and they are soluble in KOH, H2O2and NaClO, but not in water, ethanol and acetone. Infrared spectrum analysis showed that the wall-bound melanin and extracellular melanin belonged to the same type. Tricyclazole, a specific inhibitor of DHN melanin synthesis, could inhibit the fungal melanin’s biosynthesis ofA.anemones. The homologous fragment of polyketide synthase gene (AaPKS) was amplified by PCR usingA.anemonesgenomic DNA as a template. The results suggested that the melanin inA.anemonesmight be synthesized from DHN pathway.

Ascochytaanemones; melanin; infrared spectra scanning; DHN pathway

2014-04-28

：2014-08-04

S 432.1

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.005

* 通信作者 E-mail:fujunfan@163.com