菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

胡加谊， 罗志文， 李向宏， 范鸿雁, 周 朋，章绍延， 张治礼， 刘志昕， 何 凡*

(1.海南省农业科学院热带果树研究所/农业部海口热带果树科学观测实验站， 海口 571100；2.海南省农垦科学院， 海口 570206；3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室， 海口 571101)

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

胡加谊1,2， 罗志文1， 李向宏1， 范鸿雁1, 周 朋3，章绍延3， 张治礼1， 刘志昕3， 何 凡1*

(1.海南省农业科学院热带果树研究所/农业部海口热带果树科学观测实验站， 海口 571100；2.海南省农垦科学院， 海口 570206；3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室， 海口 571101)

菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-1, PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1 CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物，建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为y=-3.307×logx+38.18，相关系数r2为0.998。试验结果表明，该方法能特异性地检测PMWaV-1，对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应；最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%，是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。

菠萝凋萎相关病毒-1; TaqMan探针; 实时荧光定量RT-PCR; 检测

菠萝凋萎病(mealybug wilt of pineapple, MWP)是世界各菠萝主产区最重要的病害之一，对菠萝生产造成严重影响[1-2]。海南、广东、广西等地均有MWP发生[3,8-10]，海南琼海菠萝园发病率高达60%以上， 经济损失高达25%～30%[3-4]。MWP被认为是菠萝凋萎相关病毒-2(Pineapplemealybugwilt-associatedvirus-2)与菠萝粉蚧共同危害所引起[5-6]。然而，田间调查发现在菠萝种植区检出率最高的菠萝凋萎相关病毒是PMWaV-1[7-10]，受PMWaV-1侵染的菠萝植株平均单果重下降，早熟果比率升高，严重时可导致田间损失高达30%[11-12]。病毒性病原引起的植物病害目前没有防效显著的药剂可供选择，为降低菠萝凋萎病带来的损失，选用无毒繁殖材料至关重要，而菠萝凋萎相关病毒在寄主植株体内含量普遍很低，所以为避免普通RT-PCR检测灵敏度所限而呈现的假阴性现象，提高种苗筛选质量和筛选效率，急需建立一种快速、准确、高灵敏度的方法。由于PMWaV-2被认为是引起MWP的直接病原，因此目前菠萝凋萎病毒的检测主要是针对PMWaV-2， PMWaV-1的检测方法仍局限于组织免疫印迹[13-14]、免疫电镜(ISEM)和RT-PCR[15]。但免疫学方法操作复杂，病毒较难提纯而难以获得单克隆抗体；普通RT-PCR对假阴性样本的检测灵敏度有限且核酸后处理需要接触EB等有毒试剂，还容易引起交叉污染造成假阳性。随着分子生物学检测技术的发展，实时荧光定量RT-PCR技术得到了长足发展，因其灵敏度高、操作简便，越来越多地被用于植物病毒的定量检测。

本研究根据PMWaV-1外壳蛋白(coat protein)基因的保守序列设计特异性引物和探针，通过多次试验优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测体系，建立了基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法，以期为菠萝无毒繁殖材料的筛选提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料

用于构建PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法的菠萝植株样品采自海南省农业科学院热带果树研究所科研基地；样品检测材料采自海南省澄迈县福山镇果园，包括‘巴厘种’、‘台农16号’、‘台农17号’3个菠萝品种的老叶、嫩叶和吸芽共12个样品。所有植物材料经液氮处理，研磨成粉末状，于-80 ℃冰箱保存，备用。

1.1.2 试剂及仪器

RNA提取试剂盒为BioTeke公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix和Trans5α Cell购自TransGen公司；pMD18-T载体、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2000、Real Master Mix(Prob)均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自Axygen公司；TaKaRa TP600 PCR仪；Stratagene公司的Mx3005 荧光定量PCR仪；美国Thermo NanoDrop ND-2000C微量紫外分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 引物和探针的设计

根据NCBI核酸数据库中PMWaV-1 CP基因(HE983617, EU769114, JN995532, JN995531)的保守序列，设计一条特异性探针和一对特异性引物，探针5′ 标记HEX荧光基团，3′ 标记BHQ2淬灭基团。引物和探针由上海生工生物工程公司合成。引物和探针序列见表1。

表1 PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR引物和探针Table 1 Primers and probe designed for detection and quantification of PMWaV-1 by RT-qPCR

1.2.2 菠萝叶片总RNA 提取与cDNA合成

称取0.1 g的菠萝叶片基部白色组织，按照BioTeke公司的多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)说明书提取总RNA。以提取的总RNA为模板，参照TransGen公司的TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书反转录生成第一链cDNA。反转录反应体系为：总RNA 5 μL、Anchored Oligo(dT)primer(0.5 μg/μL) 1 μL、Random Primer(0.1 μg/μL) 1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA-free Water 补足至20 μL。混合液置于42 ℃水浴1 h后，85 ℃孵育5 min结束反应。反转录生成的第一链cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 质粒标准品的制备

1.2.3.1RT-PCR扩增及PCR产物回收

20 μL RT-PCR扩增体系包含TranGenTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+) 2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 1 μL，PMWaV-1-F(10 μmol/L) 0.5 μL，PMWaV-1-R(10 μmol/L) 0.5 μL，cDNA1 μL和ddH2O 14.8 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循环35次；72 ℃ 10 min，16 ℃ 保温。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并参照Axygen公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，回收PCR产物。

1.2.3.2连接转化和质粒提取

按照TaKaRa公司pMD18-T载体说明书将回收片段连接到pMD18-T载体上，转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆于含Amp的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养12 h以上。提取质粒，经菌液PCR、测序确定目标序列。以核酸蛋白测定仪测定阳性质粒浓度，按照公式C=A/B×6.02×1014[其中C为拷贝/μL，A为以A260分析得到的浓度(ng/μL)，B为质粒DNA分子量]计算质粒拷贝数，按10倍梯度稀释质粒，-20 ℃保存，作为标准品备用。

1.2.4 实时荧光定量RT-PCR反应体系优化

1.2.4.1反应体系标准

25 μL反应体系中加入Premix ExTaq(probe qPCR)(2×) 12.5 μL，10 μmol/L PMWaV-1-F 和PMWaV-1-R各0.5 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.5 μL，10 μmol/L PMWaV-1-Probe 1 μL，模板1 μL，ddH2O 9 μL。反应程序为：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃ 变性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，循环40次。

1.2.4.2反应体系优化

以含目的片段的质粒DNA为模板，在保证1.2.4.1反应体系中其他条件一致下，逐项优化引物浓度、探针浓度和Premix ExTaq浓度，各个优化项目浓度梯度设置如表2。

表2 实时荧光定量RT-PCR反应体系浓度优化Table 2 Optimization of the concentrationfor RT-qPCR reaction system

1.2.5 标准曲线的建立

以10倍梯度稀释含目的片段的质粒标准品，取终浓度为4.05×103～4.05×108拷贝/μL的6个浓度梯度的质粒样品为模板，按1.2.4.2中优化后的实时荧光定量RT-PCR反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出不同浓度质粒的荧光扩增曲线，仪器软件自动生成标准曲线。

1.2.6 实时荧光定量RT-PCR检测方法评价

1.2.6.1特异性试验

选取带有PMWaV-2、PMWaV-3的菠萝叶片总RNA反转录生成的cDNA与带有PMWaV-1 CP片段的重组质粒在相同的条件下进行实时荧光定量RT-PCR扩增，同时设置阴性对照。

1.2.6.2灵敏度试验

以终浓度为4.05×100～4.05×108拷贝/μL共9个梯度浓度的质粒标准品作为模板，按优化的反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出荧光定量RT-PCR对PMWaV-1的最低检测限，并与普通RT-PCR检测方法的灵敏度进行比较。

1.2.6.3重复性试验

以终浓度为4.05×103～4.05×107拷贝/μL共5个稀释浓度的质粒标准品为模板进行实时荧光定量RT-PCR反应，每个浓度设置3个重复，连续3 d即设置3次试验重复，根据试验所获得的Ct值计算平均Ct值、标准差和变异系数。

1.2.7 样品检测

以12个待测样品的cDNA作为模板，按1.2.4.2中优化后的实时荧光定量RT-PCR反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出不同样品的荧光扩增曲线，得到荧光扩增曲线的Ct值，将Ct值带入1.2.5所得的标准曲线，计算各检测样品的病毒拷贝数。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

以菠萝总RNA反转录生成的第一链cDNA为模板扩增PMWaV-1 CP基因片段，结果显示，引物对PMWaV-1-F和PMWaV-1-R能够灵敏地扩增到一条清晰的、与预测片段大小一致的片段(图1)，经测序分析及BLAST比对，确定所获得的序列为PMWaV-1 CP基因片段。

图1 凝胶电泳分析RT-PCR扩增产物Fig.1 RT-PCR amplification analyzed by agarose gel electrophoresis

2.2 质粒标准品质量鉴定及拷贝数计算

根据紫外分光光度计测得A260/A280为1.87，说明质粒标准品纯度较高；并根据公式计算质粒标准品的拷贝数为4.05×108拷贝/μL。将质粒标准品按10倍稀释为4.05×100～4.05×109拷贝/μL共9个梯度，4 ℃保存备用。

2.3 实时荧光定量RT-PCR反应体系优化

由图2可以看出，PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测体系优化的结果为，Premix ExTaq(2×)13 μL，10 μmol/L PMWaV-1-F和10 μmol/L PMWaV-1-R各200 nmol/L，PMWaV-1-Probe 400 nmol/L。

图2 实时荧光定量RT-PCR反应体系优化Fig.2 Optimizing reaction mix of RT-qPCR

2.4 标准曲线建立

以质粒标准品浓度值为横坐标，RT-qPCR反应的Ct值为纵坐标，根据终浓度为4.05×103～4.05×108拷贝/μL 6个梯度的质粒标准品的RT-qPCR检测结果构建标准曲线(图3)。标准曲线为y=-3.307 logx+38.18，扩增效率为100.6%，质粒拷贝数的对数与Ct值线性相关系数r2为0.998。表明所建立的RT-qPCR方法满足对PMWaV-1检测试验的可信度要求，可用于后续试验。

图3 PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测标准品动力曲线图Fig.3 Standard curve of RT-qPCR for PMWaV-1

2.5 PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法评价

2.5.1 特异性试验

特异性试验结果如图4，除了含PMWaV-1目的片段的阳性质粒出现很好的扩增曲线外，PMWaV-2、PMWaV-3和阴性对照检测结果均无荧光吸收值的变化，表明本试验所建立的PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法具有很高的特异性。

图4 PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR特异性试验Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-1

2.5.2 灵敏度试验

实时荧光定量RT-PCR与普通RT-PCR检测方法灵敏度比较试验结果(图5)表明，PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度比普通RT-PCR检测方法高10倍。

图5 PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR灵敏度(a)与普通RT-PCR检测灵敏度(b)Fig.5 The sensibility of RT-qPCR(a)and general RT-PCR(b) for PMWaV-1

2.5.3 重复性试验

重复性试验结果(表3)表明，PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法在同一批次试验中，各浓度梯度扩增曲线Ct值的变异系数均小于0.23%，各梯度批间变异系数均小于1.98%，表明该方法具有良好的重复性，可用于PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR定量检测。

表3 重复性试验统计结果Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility of RT-qPCR for PMWaV-1

2.6 样品检测

从海南省澄迈县采集的12个菠萝植株样品实时荧光定量RT-PCR检测结果(图6)表明，该方法对12个样品均能特异性地检测到PMWaV-1，并且不同植株、相同植株不同生长部位病毒含量均有一定差异，其中老叶病毒含量较高，嫩叶次之，吸芽病毒含量最少。

图6 不同菠萝植株不同生长部位PMWaV-1拷贝数Fig.6 Copies in different tissues of pineapple plants infected by PMWaV-1

3 讨论

目前通用的实时荧光定量检测系统主要有两类：一类是非特异的DNA嵌入染料(如SYBR Green I)；另一类是以杂交形式进行的单链检测系统，如水解探针(如TaqMan)、杂交探针(如LightCycler)等。非特异性染料是与双链DNA相结合的染料，其优点是能适用于任何一对引物，成本较低。但存在与非特异性扩增片段和引物二聚体等结合产生假阳性的现象，影响试验的可信度。本试验所采用的是特异性染料，TaqMan水解探针，它能够高特异性地结合目的片段，避免了非特异性染料较易出现的假阳性现象。同时，通过与GenBank上报道的PMWaV-1 CP基因序列进行比对，发现PMWaV-1 CP基因的同源性高达99.16%，此外，本试验选取了CP基因上相对保守的序列设计高特异性的TaqMan探针，最大程度避免了因为不同病毒分离物序列差异导致探针无法结合到靶标序列而造成的假阴性现象。

实时荧光定量PCR在方法学上分为两类：绝对定量和相对定量。其中绝对定量方法在植物RNA病毒的应用中一般选取体外转录的RNA作为标准品，但此类标准品较难制备和保存。所以，本试验是通过制备重组质粒作为标准品，建立标准曲线达到对PMWaV-1的绝对定量。这样就减少了体外转录RNA标准品制备的步骤和消耗，重组质粒的标准品也更加利于保存。样品检测中，对各个样品所提取的总RNA进行质量和浓度测定后，将RNA浓度稀释到相同水平，在相同的反应体系中同时反转录为cDNA，作为PMWaV-1实时荧光定量PCR检测的模板，这样就有效减小了因样品RNA提取效率和反转录效率引起的误差。

在我国，实时荧光定量PCR技术目前已在柑橘衰退病毒[16]、香蕉苞片花叶病毒[17]、苹果茎沟病毒[18]和甘蔗黄叶病毒[19]等多种果树病毒检测上得以应用，体现出了高特异性、高灵敏度、快速、安全等优点。在本研究中，样品检测结果显示，海南菠萝MWP具有显著的假阴性现象，且普通RT-PCR检测较不稳定，不能客观反映样本的带毒情况，而本研究建立的实时荧光定量PCR检测体系可以检测到低拷贝的病毒，灵敏度高，所得到的结果更加客观、可信。

本试验建立的PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR技术不仅可以为菠萝种苗筛选及菠萝组培苗培育过程中病毒含量的检测和监控提供技术支持，还可应用于病毒在植株体内运动复制规律及其与寄主互作机制的研究。

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Developmentandapplicationofreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRmethodforthedetectionofPineapplemealybugwiltassociatedvirus-1

Hu Jiayi1,2, Luo Zhiwen2, Li Xianghong1, Fan Hongyan1,Zhou Peng3, Zhang Shaoyan3, Zhang Zhili1, Liu Zhixin3, He Fan1

(1.InstituteofTropicalFruitTrees,HainanAcademyofAgriculturalScience/HaikouInvestigationStationofTropicalFruitTrees,MinistryofAgriculture,HainanHaikou571100; 2.AgriculturalReclamationAcademyofSciences,Haikou570206,China; 3.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,P.R.China,InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou571101)

Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-1(PMWaV-1) highly infected pineapple in growing region in Hainan Province. A method of real-time fluorescent quantitative RT-PCR was established and optimized by using TaqMan probe and specific primers according to conserved sequence from the coat protein(CP) gene of PMWaV-1. The standard curve of the method wasy=-3.307×logx+38.18,r2=0.998. The results showed that the method was specific to PMWaV-1 and minimum detectable copies were 40. Both the variation coefficient of intra-assay and inter-assay for the method were less than 1.98%. Therefore, the established real-time fluorescent quantitative RT-PCR is a sample, specific, sensitive and reproducible method for PMWaV-1 detection. Detection analysis indicated that the content of PMWaV-1 in old leaves, younger leaves and suckers went down gradually.

PMWaV-1; TaqMan probe; real-time fluorescent quantitative RT-PCR; detection

2014-01-03

：2014-05-16

公益性行业(农业)科研专项(201203021)；海南省重大科技项目(ZDZX2013020-3)；海南省科学事业费项目(琼财预[2013] 131号)；海南省重点科技计划应用研究及产业化项目(ZDXM20130031)；海南省自然科学基金(琼科[2013]32号)

S 436.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.021

致谢：本试验主要在中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室完成，在此，对本实验室的各位老师和同学提供的试验条件和试验操作的指导表示诚挚的谢意。

* 通信作者 E-mail：hefanhn@163.com