9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌的室内毒力测定及配比试验

唐爽爽， 刘志恒*， 余朝阁， 赵廷昌

(1. 沈阳农业大学植物保护学院,沈阳 110866; 2. 中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)

9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌的室内毒力测定及配比试验

唐爽爽1， 刘志恒1*， 余朝阁1， 赵廷昌2

(1. 沈阳农业大学植物保护学院,沈阳 110866; 2. 中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)

为筛选防治西瓜炭疽病的高效低毒杀菌剂，缓解和治理生产中病菌对药剂的抗性，在室内离体条件下采用生长速率抑制法及孢子萌发抑制法测定了9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的毒力。结果表明，嘧菌酯、咪鲜胺和甲基硫菌灵对病原菌菌丝生长的EC50在0.093 3～0.118 2 mg/L之间，均小于1 mg/L，表明西瓜炭疽病菌对上述杀菌剂比较敏感；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的EC50在2.310 1～5.925 9 mg/L，病菌对药剂的敏感程度相对较低；代森锰锌、恶霉灵和多菌灵的EC50分别为36.876 3、74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌活性较差。孢子萌发试验中，嘧菌酯、咪鲜胺和甲基硫菌灵对病菌孢子萌发的抑制活性最高，EC50在0.069 4～0.167 2 mg/L之间；百菌清、烯肟菌酯、代森锰锌的抑制活性次之，EC50在1.853 0～9.503 9 mg/L之间；多菌灵的抑制活性相对最低，EC50为99.335 3 mg/L。将两种不同作用机理的杀菌剂嘧菌酯与咪鲜胺按照2∶1的比例混配，联合毒力测定和评价结果表明两者混配对抑制西瓜炭疽病菌具有增效作用。

西瓜炭疽病菌； 杀菌剂； 毒力测定； 混配

西瓜是世界十大水果之一，据联合国粮农组织(FAO)统计，西瓜在世界果品中占第5位，在夏季市场水果供应上居首位，被誉为“夏季水果之王”。我国是世界上最大的西瓜生产国，占世界总面积和总产量的45%以上[1]。西瓜炭疽病[Colletotrichumorbiculare(Berk.etMont.) Arx]是西瓜生产上重要病害之一，在世界各地西瓜栽培地区均有发生，尤其以湿度大地区发生最普遍。近年来，随着全球变暖趋势的加重以及西瓜种植面积的不断增加，西瓜重茬面积不断扩大，导致炭疽病日益加重。西瓜炭疽病一旦发生，就会造成严重减产，甚至绝收[2]。在辽宁省西瓜主产区辽中县，西瓜炭疽病广泛发生，对西瓜生产构成了严重威胁[3]。近年来，西瓜炭疽病在辽宁省建平县露地西瓜栽培中有逐年加重的趋势，已成为西瓜栽培生产中的3大主要病害之一，严重影响了西瓜的产量和品质[4]。

目前，国内外关于西瓜炭疽病菌的研究多侧重于病害的发生原因与规律，有的已深入到分子水平[5]。生产上由于缺乏抗性品种，化学药剂防治仍是控制病害的重要措施，但某种药剂长期单一使用、用药次数和剂量不断增加，导致药剂抗药性出现的问题，已在很多病害防治中有所显露而影响了病害防控效果。鉴此，本文选用9种杀菌剂原药，采用菌丝生长速率抑制法和分生孢子萌发抑制法对西瓜炭疽病菌进行了室内毒力测定，并研究了杀菌剂混配的抑菌效果，以期为西瓜炭疽病的田间防治筛选出作用机制不同且高效、低毒的杀菌剂，为生产上减缓病菌抗药性的产生以及病害的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种来源

2012年8月，于辽宁省沈阳新民市、营口盖州市和阜新彰武县采集西瓜炭疽病标样，采用常规组织分离法[6]获得病原菌，经致病性测定验证。将病菌经纯培养扩繁后保藏备用。

1.2 供试药剂

选用生产上常规应用的9种杀菌剂：95%嘧菌酯原药(湖北晟隆化工有限公司)、97%咪鲜胺原药(湖北晟隆化工有限公司)、97%甲基硫菌灵原药(江苏省新沂利民化工有限责任公司)、98%百菌清原药(山东华阳农药肥料化工有限公司)、95%烯肟菌酯原药(杭州中润生物科技有限公司)、95%戊菌唑原药(浙江省杭州宇龙化工有限公司)、80%代森锰锌原药(江苏省新沂利民化工有限责任公司)、95%恶霉灵原药(山东京博农化有限公司)及98%多菌灵原药(上海临空化工贸易有限公司)。

1.3 接种体及孢子悬浮液的制备

病菌培养：应用PSA培养基，将分离纯化的病菌于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养15 d，用直径7 mm的灭菌打孔器在菌龄相近、长势一致的菌落部位打取菌饼备用。

菌悬液制备：取培养30 d的PSA平板，每皿加入无菌水5 mL，配成分生孢子悬浮液，孢悬液浓度为40倍镜下平均每视野60～80个孢子[7]。

1.4 试验方法

对西瓜炭疽病菌的室内毒力测定，分别采取菌丝生长速率抑制法[8]和孢子萌发抑制法[9]进行筛选，计算9种供试杀菌剂的抑制中浓度(EC50)。

菌丝生长速率抑制法：根据预试验结果，选择各药剂适当的5个浓度(表1)，将配制好的供试药剂母液按照设定的浓度比例加入到已融化并冷却至50 ℃左右的PSA培养基中，充分混匀后分别倒入直径9 cm的灭菌培养皿中，制成系列浓度的含药PSA平板。以不加药剂但含等量溶剂的PSA平板为对照。接入直径7 mm的菌饼，25 ℃恒温培养。每处理设3次重复。15 d后采用十字交叉法测定菌落直径[10]，并计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

分生孢子萌发抑制法：根据预试验结果，选择各药剂适当的5个浓度(表2)，孢悬液浓度为40倍镜下60～80个孢子，分别吸取孢悬液0.5 mL与配制好的待测农药母液(含2%葡萄糖)0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌发法。无菌水为对照。25 ℃恒温保湿培养。每处理3次重复。12 h后测定孢子萌发率。每个处理随机镜检100个分生孢子，记载孢子萌发数。

孢子萌发率(%)=已萌发孢子数/镜检孢子总数×100；

孢子萌发抑制率(%)=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100。

2种杀菌剂混配效果测定：根据单剂毒力测定结果，对毒力最高的2种药剂95%嘧菌酯和97%咪鲜胺进行混配[11]，有效成分配比为：4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4，每个配比配制成相应5个浓度梯度。采用生长速率法对西瓜炭疽病菌进行联合毒力测定。计算混配剂对菌丝生长抑菌率，分别求得药剂不同混配比例的毒力回归方程、EC50和相关系数。并根据Wadley公式计算增效系数SR[12]，确定不同比例混剂的相互作用。

EC50理论值 =(a+b)/〔(a/EC50A)+(b/EC50B)〕

SR=EC50(理论值)/EC50(实际值)

式中A、B分别为95%嘧菌酯和97%咪鲜胺单剂；a、b分别为相应单剂在混剂中含量的比率；以SR值代表相互作用程度。当SR≤0.5时，表示拮抗作用；当SR≥1.5时，表示增效作用；当SR在0.5～1.5之间时，表示加和作用。

1.5 数据处理与统计分析

采用DPS统计软件和Excel软件对测定数据进行处理和计算[13]，将菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率分别换算成几率值(y)，药剂浓度换算成浓度对数(x)，按浓度对数与几率值回归法求得线性回归方程(毒力回归式)y=a+bx，并以回归方程计算各供试药剂对西瓜炭疽菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制中浓度(EC50)、几率值与浓度对数之间回归的相关系数r值，比较不同杀菌剂对西瓜炭疽病菌的抑制作用。

2 结果与分析

2.1 9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌菌丝生长的影响

不同浓度的杀菌剂与其对西瓜炭疽病菌的抑制率之间是一种不对称的S形曲线关系，将浓度转化为对数，抑制率转化为几率值时，浓度与抑制率之间表现为一元线性回归关系，通过相关性分析，可以检验线性关系的显著性，分析比较杀菌剂对病菌的毒力。

各供试药剂供试浓度、毒力回归方程、相关系数r和EC50结果见表1。

表1 供试9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Toxicity of nine fungicides on mycelium growth of Colletotrichum orbiculare

根据菌丝生长抑制法测定的EC50结果(表1)表明，供试9种杀菌剂基本归为4类：95%嘧菌酯、97%咪鲜胺和97%甲基硫菌灵，EC50分别是0.093 3、0.108 3和0.118 2 mg/L，比其他供试药剂的EC50小，说明这3种药剂抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、95%戊菌唑，EC50介于2.310 1～5.925 9 mg/L之间，在供试药剂中EC50较小，说明这3种药剂抑菌效果较好；80%代森锰锌EC50为36.876 3 mg/L，说明该药剂抑菌效果一般；95%恶霉灵和98%多菌灵的EC50分别为74.466 6和99.898 5 mg/L，抑菌效果很差。

回归方程的斜率与杀菌剂对病菌的敏感性成正比。按回归方程的斜率k，供试药剂可以分为2类：95%戊菌唑、97%甲基硫菌灵、95%烯肟菌酯、98%百菌清、98%多菌灵、95%嘧菌酯和97%咪鲜胺，斜率k在1.028 2～1.380 3之间，是供试药剂中斜率k较大的，说明西瓜炭疽病菌对这7种药剂的敏感性较高；95%恶霉灵、80%代森锰锌，斜率k在0.666 9～0.829 7之间，是供试药剂中斜率k较小的，说明西瓜炭疽病菌对这2种药剂的敏感性较低。

2.2 9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌分生孢子萌发的影响

各药剂供试浓度、毒力回归方程、相关系数r和EC50结果见表2。

根据分生孢子萌发抑制法测定的EC50结果(表2)表明，供试9种杀菌剂基本归为4类：95%嘧菌酯、97%咪鲜胺和97%甲基硫菌灵，EC50分别是0.069 4、0.090 7和0.167 2，大于其他药剂的EC50，说明这3种药剂抑菌效果最好；98%百菌清、95%烯肟菌酯、80%代森锰锌，EC50介于1.853 0～9.503 9 mg/L之间，是供试药剂中EC50较小的，说明这3种药剂抑菌效果较好；95%戊菌唑的EC50为14.830 3 mg/L，说明该药剂抑菌效果一般；95%恶霉灵的EC50为79.271 1 mg/L，抑菌效果较差，98%多菌灵的EC50为99.335 3 mg/L，说明该药剂抑菌效果最差。

表2 供试9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌分生孢子萌发的抑制作用Table 2 Toxicity of nine fungicides on spores germination of C.orbiculare

回归方程的斜率与杀菌剂对病菌的敏感性成正比。按回归方程的斜率k，供试药剂可以分为2类：95%恶霉灵、95%戊菌唑、98%多菌灵、95%嘧菌酯、95%烯肟菌酯、97%咪鲜胺和80%代森锰锌，斜率k在1.219 1～1.573 2之间，大于其他供试药剂的斜率k，说明西瓜炭疽病菌对这7种药剂的敏感性较高；97%甲基硫菌灵、98%百菌清，斜率k在0.894 4～0.917 5之间，是供试药剂中斜率k较小的，说明西瓜炭疽病菌对这2种药剂的敏感性较低。

2.3 杀菌剂嘧菌酯和咪鲜胺混配联合毒力测定

由表3可知，95%嘧菌酯与97%咪鲜胺以 4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4的比例混配对西瓜炭疽病菌的EC50分别为0.075 7、0.043 3、0.103 9、0.107 1和0.105 9 mg/L，均表现出了显著的抑菌作用。同时，95%嘧菌酯与97%咪鲜胺的4∶1和2∶1混配剂的EC50均小于95%嘧菌酯单剂和97%咪鲜胺单剂的EC50，表明这两种比例混配剂对西瓜炭疽病病菌的抑制效果明显好于单剂。95%嘧菌酯与97%咪鲜胺的4∶1和2∶1两种混配剂的SR，分别为1.268 2和2.260 0，前者介于0.5和1.5之间，表示加和作用，后者SR大于1.5，表明比例为2∶1的混配表现为增效作用。其余4种混配比例的SR均介于0.5和1.5之间，均为加和作用。

3 结论与讨论

菌丝生长速率抑制法的毒力测定结果表明，9种杀菌剂对西瓜炭疽病菌的EC50大小顺序为：嘧菌酯>咪鲜胺>甲基硫菌灵>百菌清>烯肟菌酯>戊菌唑>代森锰锌>恶霉灵>多菌灵，其中嘧菌酯对菌丝生长抑制作用最强，EC50为0.093 3 mg/L；百菌清、烯肟菌酯和戊菌唑的抑制作用较好；多菌灵的抑制作用最弱，EC50为99.335 3 mg/L。分生孢子萌发法的毒力测定结果表明，9种药剂对西瓜炭疽病菌的EC50大小顺序为：嘧菌酯>咪鲜胺>甲基硫菌灵>百菌清>烯肟菌酯>代森锰锌>戊菌唑>恶霉灵>多菌灵，其中嘧菌酯对分生孢子萌发的毒力最强，EC50为0.069 4 mg/L；百菌清、烯肟菌酯、代森锰锌毒力次之；多菌灵的EC50为99.335 3 mg/L，毒力最小。嘧菌酯和咪鲜胺为毒力最高的2种药剂，这与周文静等[14]的研究结果相一致，与付余波等[15]报道的梨炭疽病菌的毒力测定相吻合。在本试验中，采用联合毒力测定得出当嘧菌酯与咪鲜胺以2∶1的比例混配时表现为增效作用。

表3 嘧菌酯与咪鲜胺混配对西瓜炭疽病菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Toxicity of azoxystrobin and prochloraz mixed on mycelium growth of C. orbiculare

同一杀菌剂对病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用可存在差异，戊菌唑对菌丝生长抑制作用较强，但对孢子萌发抑制作用较弱，故可在发病的初期使用；而代森锰锌对孢子萌发抑制作用较强，对菌丝生长抑制作用较弱，故可在发病前喷施,预防病菌孢子的初侵染，并可在发病期喷施，防止孢子再侵染，与王春明等[9]报道结果较为一致。

不同杀菌剂敏感性测定中斜率越大说明病菌对药剂的反应灵敏度越高，即随着质量浓度的增加，抑菌率明显增大[16]。西瓜炭疽病菌的菌丝生长对咪鲜胺的敏感性最高，孢子萌发对代森锰锌和咪鲜胺的敏感性最高。

多菌灵是苯并咪唑类杀菌剂，若长期使用，易产生抗药性[17]，试验中多菌灵对该菌的毒力最差，从而推测西瓜炭疽病菌对多菌灵已产生了一定的抗药性，这可能与当地田间多菌灵使用量和喷药次数过多相关，此结果与多菌灵的药理相符合。葡萄、香蕉、苹果等植物上的胶孢炭疽病菌也出现类似的不同程度敏感性降低的情况[18-20]，与本试验结果相吻合。因此，应对多菌灵的抗药性给予高度的重视，及早采取相应措施，例如轮换使用不同作用机制的杀菌剂，合理适量用药，并进一步研究炭疽菌对多菌灵的抗药性机理，避免抗药性加重。

室内药剂毒力测定结果虽可看出药剂对菌丝和孢子萌发具有很好的抑制效果，为农业生产上防治该病提供了理论依据。但由于受很多因素的影响，药剂在培养皿内的抑菌活性和在田间植物上的作用效果不一定完全一致，因此还有待做进一步田间的防治效果试验。

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ToxicitydeterminationandproportioningtestsofninefungicidestoColletotrichumorbiculare

Tang Shuangshuang1, Liu Zhiheng1, Yu Zhaoge1, Zhao Tingchang2

(1.CollegeofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China;2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The effects of nine fungicides and their mixtures onColletotrichumorbicularewere tested with the mycelium growth rate and spores germination methods in vitro in laboratory. The results showed that azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had significant inhibition activity on mycelium growth, with the EC50values ranged from 0.093 3 to 0.118 2 mg/L. Chlorothalonil, enestroburin and penconazole were less effective, with EC50values between 2.310 1 and 5.925 9 mg/L. Mancozeb, hymexazol and carbendazim were least effective, with EC50values of 36.876 3, 74.466 6 and 99.898 5 mg/L, respectively. Azoxystrobin, prochloraz and thiophanate-methyl had the best inhibitory actions on the spore germination, with the EC50values of 0.069 4-0.167 2 mg/L. Chlorothalonil， enestroburin and mancozeb had less effects(with EC50of 1.853 0-9.503 9 mg/L), while carbendazim(with EC50of 99.335 3 mg/L) took the last place. Synergistic inhibition on mycelium growth was obtained when azoxystrobin and prochloraz were mixed.

Colletotrichumorbiculare; fungicides; toxicity determination; mixture

2013-12-11

：2014-01-11

国家西甜瓜产业技术体系(CARS-26)

S 481.9

：BDOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.033

* 通信作者 E-mail:805141919@qq.com