基于ITS序列的紫芝分子鉴定

苏春丽,唐传红,张劲松*(1.成都医学院公共卫生系,成都 610500；.上海市农业科学院食用菌研究所,上海 01403)

·论 著·

基于ITS序列的紫芝分子鉴定

苏春丽1,2,唐传红2,张劲松2*
(1.成都医学院公共卫生系,成都 610500；2.上海市农业科学院食用菌研究所,上海 201403)

目的 建立基于ITS序列的紫芝分子鉴定方法。 方法 分析20株灵芝属菌株ITS序列,设计紫芝的特异性引物。 结果 用此引物对20株灵芝属菌株的DNA进行扩增,只有2株紫芝菌株有目的扩增条带。 结论 设计的特异性引物有很高的专属性,能高度特异地鉴定紫芝菌株。

紫芝；ITS序列；分子鉴定

紫芝(Ganodermasinense)又称黑芝、中国灵芝等,是中国特有的食药用真菌之一。紫芝气味甘、性温、无毒,具有治耳聋、利关节、保神、益精气、坚筋骨、好颜色以及久服轻身延年不老的作用。紫芝是《中国药典》(2010年版)记载的两种可药用灵芝之一,也是卫生部发布的可用于保健食品的三种灵芝之一[1-5]。

随着对紫芝生物学功效的不断了解和认识,其市场需求也在不断增加,紫芝原料的质量越来越受到重视。但是由于灵芝属菌株种类多,传统鉴定主要依据形态学特征来进行,容易出现混淆。

ITS是rDNA的内转录间隔区,不加入成熟核糖体,受到的选择压力较小,进化速度较快,在绝大多数真核生物中有着极为广泛的序列多态性；ITS序列长度适中,能从不太长的序列中获得充分的信息；同时ITS区在核基因组中是中等重复的,由于协同进化,各重复单位高度相似或者一致,从而使得PCR产物可以直接测序；另外,ITS序列种内同源性非常高,在种间又有不同程度的变异。这些优点使得ITS序列成为理想的种间鉴定分子标记,并已广泛应用于真菌的分子分类学、遗传多样性及菌株鉴定等方面的研究[6-8]。本文拟通过分析灵芝属菌株ITS序列间的差异,设计紫芝的特异引物,建立紫芝的分子鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本研究共收集了灵芝(Ganodermalucidum)、密纹薄芝(Ganodermatenue)、紫芝(Ganodermasinense)、树舌(Ganodermaapplanatum)、松杉树芝(Ganodermatsugae)、近拟鹿角灵芝(Ganodermasubamboinense)、紫光灵芝(Ganodermaoerstedii)及无柄灵芝(Ganodermaresinaceum)等8个种共20株灵芝属菌株(见表1)。

1.2 培养基

马铃薯液体培养基(每1 000 mL中马铃薯200 g,葡萄糖20 g)。

1.3 主要试剂和仪器

引物(Invitrogen合成)、Taq酶(promega)、DNA分子量标准(天为时代D2000)和PCR仪(effendorf)。

1.4 方法

1.4.1 菌丝培养和DNA提取方法 菌种经活化后接种于马铃薯液体培养基中,28 ℃振荡(150 r/ min)培养10～15 d,收集菌丝,-20 ℃保存备用。DNA提取参照唐传红等[9]的方法进行,经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,-20 ℃保存备用。

表1 供试菌株

ATCC：美国典型培养物保藏中心

1.4.2 ITS序列分析方法 根据Genbank中已有的灵芝属菌株ITS序列信息,确定ITS1、ITS2和5.8S的序列范围。依据常用的兼并碱基代码将ITS序列中所含的杂合位点重新编码,用DNAStar软件将DNA序列转换成FastA格式,再利用ClustalX 1.8软件进行排列分析。

1.4.3 DNA模板的检验 用真菌ITS区通用引物ITS1F/ITS4对所有DNA模板进行扩增,验证DNA的质量能否满足PCR反应的要求。扩增反应体系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,引物ITS1F/ITS4(10 μmol/L)各1 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,DNA模板10 ng,用无菌双蒸水补足。PCR扩增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共28个循环；72 ℃ 5 min。

1.4.4 紫芝特异性引物的设计及验证 根据20个菌株ITS序列比对的结果,寻找紫芝的序列特异位点,设计紫芝的特异性引物,进而对所有菌株的DNA进行扩增,验证引物的特异性。紫芝鉴定PCR的反应体系除引物为GS1/GS2外,其他与ITS区相同；PCR扩增程序中的退火温度为65 ℃,其他与ITS区相同。

2 结果

2.1 基于ITS序列设计紫芝的特异性引物

对20株灵芝属菌株的ITS序列进行比对分析[10,11],寻找紫芝ITS序列的特异位点,设计出紫芝的特异引物。引物名称与序列分别是GS1： ACG GAC TGT GGA GCG GGC TCT G；GS2：GTC ATA AGC TTT GTC TCC ATA C。

2.2 DNA模板的检验

用真菌ITS区通用引物ITS1F/ITS4对所有DNA模板进行扩增,验证DNA的质量能否满足PCR反应的要求。结果显示,所有菌株DNA均能扩增出清晰的目的条带(见图1),表明所用的DNA能满足PCR反应的要求。

图1 引物ITS1F/ITS4对20个灵芝属菌株的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M：分子量标记；CK：阴性对照；代码 1～20：GL11、GL23、GTEN24、GL36、GL81、GA117、GL126、GL128、GL129、GT132、GSUB136、GSUB137、GO138、GR140、GR145、GL146、GA165、GL166、GS175、GS181

2.3 紫芝的PCR鉴定

用设计出的紫芝特异性引物GS1/GS2对20个灵芝属菌株进行PCR扩增,当退火温度为62 ℃时,紫芝菌株GS175和GS181有清晰的目的扩增条带,但11、12泳道的近似鹿角灵芝菌株GSUB136和GAUB137有较弱的大小约1 000 bp的非目的条带,其他菌株均无扩增条带。当退火温度升至65 ℃时,紫芝菌株GS175和GS181有清晰的目的扩增条带,而其他菌株均未出现扩增条带(见图2)。本文设计出紫芝的特异性引物,对20株灵芝属菌株进行扩增,只有2株紫芝菌株有清晰的目的条带,其他菌株在同等PCR条件下均无扩增产物出现。结果表明,本研究设计的特异性引物有很高的专属性,能对紫芝菌株进行分子鉴定。

图2 引物GS1/GS2对20个灵芝属菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图M：分子量标记；CK：阴性对照；图中代码同图1

3 讨论

传统的紫芝等灵芝属菌株的鉴定主要建立在形态学基础之上,但子实体的很多形态学特征往往因生长条件的不同而发生改变,并且许多特征经常是几个种所共有的,这给传统的紫芝鉴定带来了很大的困难。因此,建立起不受环境因素影响,快速可靠的紫芝鉴定方法,对保证紫芝原料的质量显得非常迫切和必要。

分子生物学的发展,为研究者对紫芝进行分子鉴定提供了技术支持。分子鉴定以菌株的遗传物质为基础,不受环境因素的影响,因而鉴定结果更为可靠。rDNA的ITS序列是用于探讨真菌种内变异和属内种间分子系统关系的重要分子标记。前期研究[10]中发现,ITS序列在灵芝属种内同源性非常高,但种间的同源性相对较低,说明ITS区的碱基变异为区分灵芝属的不同种提供了充分的信息。为此,可以ITS为靶基因,建立快速鉴定紫芝菌株的特异性PCR法。

本研究通过对20株灵芝属菌株ITS序列进行比对分析,设计出紫芝的特异性引物,并对20株菌株进行扩增,结果显示,只有2株紫芝菌株有目的条带,表明该方法能够快速鉴定紫芝菌株。

研究结果表明,基于ITS序列的真菌分子鉴定技术具有准确性高、特异性好和样品需求量少的特点,该方法易操作、成本低且实用性强。该鉴定技术为真菌的鉴定提供了新的思路和方法,可望为经济真菌的开发利用提供有益帮助。

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Molecular Detection ofGanodermasinenseBased on Nuclear Ribosomal DNA ITS Sequence

SUChun-li1,2,TANGChuan-hong2,ZHANGJing-song2*

(1.DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.InstituteofEdibleFungi,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

Objective To build a molecular detection method to identifyGanodermasinenseisolates. Methods Based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequences, A pair of specific primers were designed for identifying theGanodermasinenseby PCR. Results 20 isolates ofGanodermawere amplified by the primer pairs, only twoGanodermasinenseisolates had PCR amplification products. Conclusion It is demonstrated that the primer pairs have a high specificity, and can be used to specifically identifyGanodermasinenseisolates.

Ganodermasinense; ITS Sequences; Molecular Detection

上海市农委重点攻关项目(NO：农科攻字2002-1-4-3);成都医学院学科建设项目(NO：CYXK2012010)

张劲松, E-mail：Zhangjs888@etang.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140410.1540.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.004

R282.5

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