日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响

卢劲晔+刘静+卢炜+等

摘要：选取18只青年波杂山羊随机分成高能量组与低能量组，在细胞和分子水平阐述瘤胃上皮增殖及其机理。结果显示：高能量日粮提高山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表达，加速细胞周期G1期进程，促进细胞增殖，加快瘤胃乳头生长，揭示了高能量日粮促进瘤胃乳头生长的细胞生物学机制。

关键词：高能量日粮；山羊；瘤胃上皮；细胞周期；Cyclin D1

中图分类号： S827.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0145-04

收稿日期：2013-09-18

资助项目：国家自然科学基金（编号：30771568）；国家“973”计划（编号：2011CB100801）

作者简介：卢劲晔（1983—），男，江苏扬州人，博士，讲师，主要从事动物营养生理研究。Tel：（0523）86853000；E-mail：leopardleo@163.com。

通信作者：沈赞明，从事动物营养生理研究。E-mail：zmshen@njau.edu.cn。瘤胃是反刍动物消化代谢、营养吸收最重要的场所之一，瘤胃上皮吸收动物消化产生的能量、营养物质，瘤胃上皮的生长发育情况直接影响反刍动物的生产性能。提高动物日粮能量水平可以促进山羊瘤胃上皮生长及山羊个体生长[1]。哺乳动物体细胞数量增多是通过加快细胞的有丝分裂来完成的，细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂完成所经历的整个有序过程称为细胞周期。细胞周期运行主要受细胞周期蛋白（cyclin）及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调控，细胞周期蛋白表达水平直接影响细胞有丝分裂的速率[2]。本研究探讨高能量日粮对山羊瘤胃上皮细胞周期以及CDK的影响，旨在为提高山羊生产性能提供依据。

1材料与方法

1.1材料

选用18只青年波杂山羊（波尔山羊×淮南羊杂交山羊，平均日龄为90 d）作为试验对象。试验开始前，对山羊进行驱虫，山羊自由饮水，采食花生秆，逐渐添加精料至400 g/d，适应期30 d。试验正式开始后，根据体重相近原则，将山羊随机分为高能量组（ME：1.00 MJ/（kg0.75·d），约为维持水平的2.0倍）及低能量组（ME：0.60 MJ/（kg0.75·d），约为维持水平的1.2倍），高能量组及低能量组各9只山羊。所有山羊均单圈饲养，自由饮水，采食花生秆，日粮营养组成见表1。高能量组山羊每天08：00、11：00、14：00、17：00分别饲喂1次100 g精料（精料组成见表1），持续饲喂42 d，第43天屠宰取样。

1.2主要试剂

碘化丙啶（Sigma公司），RNA酶抑制剂、随机引物、dNTP（Promega公司），RevertAid M-MuLV反转录试剂盒、Taq DNA

山羊日粮的组成成分

日粮干物质

（%）干基营养成分含量（%）粗蛋白质粗脂肪粗纤维粗灰分干物质代谢能

（MJ/kg）饲料87.7523.804.157.608.8110.85花生秆89.818.152.2531.467.136.96注：精料由玉米、豆粕、棉籽、麸皮、鱼粉、磷酸钙、微量元素、维生素组成。

聚合酶试剂盒（Fermentas公司），引物设计与合成（Invitrogen公司），iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司），蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量分析试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司），ECL化学发光检测试剂盒（Pierce公司），PVDF膜（Millipore公司），兔抗Cyclin D1多克隆抗体、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Bioworld公司），鼠抗CDK4单克隆抗体（Abcam公司）。

1.3流式细胞术测定山羊瘤胃上皮细胞周期

1.3.1瘤胃上皮细胞的分离与固定取约300 mg组织块，用D-Hanks溶液（pH值为7.4，4倍双抗，37 ℃水浴预温）漂洗2～3次后，加0.25%胰酶15 mL，37 ℃水浴，30 min后弃去消化液，取出瘤胃上皮组织，重复3次上述步骤。在处理后的上皮组织中加D-Hanks溶液（pH值为7.4）清洗2次，继续加入胰酶15 mL消化10 min，1 500 r/min离心10 min，收集细胞。用PBS缓冲液（pH值为7.4）洗涤细胞沉淀2次，2 mL预冷75%乙醇重悬细胞，混匀后4 ℃保存待测。

1.3.2碘化丙啶（PI）染色与流式细胞仪检测将用75%乙醇固定的细胞用PBS缓冲液（pH值为7.4）洗涤2次以除去乙醇，再用50 μL PBS缓冲液（pH值为7.4）重悬，加入 500 μL PI染液，振荡混匀，室温避光染色15 min，用流式细胞仪检测，每个样品计数10 000个细胞，用CellQuest软件测定细胞大小及细胞DNA含量等数据。

1.4RT-PCR法检测山羊瘤胃上皮细胞周期蛋白、蛋白激酶mRNA

1.4.1样品总RNA提取取约100 mg瘤胃上皮组织，用手持电动匀浆机彻底匀浆后采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取瘤胃上皮总RNA。用微量核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度及纯度，所有样品RNA的D260 nm/D280 nm比值均为1.8～2.0。用1.4%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA的质量，样品条带清晰，无拖尾现象，且28 S与18 S条带灰度之比约等于2.0，表明RNA无降解、质量可靠。调整RNA浓度为 1 μg/μL，-80 ℃保存。

1.4.2反转录（RT）用随机引物同时对所有样品的RNA进行反转录，得到各样品的cDNA。反应总体积为25 μL，包括2 μg RNA、0.8 mmol/L dNTP、10 μmol/L随机引物、5 U RNA酶抑制剂、100 U M-MLV反转录酶。先加RNA模板、dNTP、随机引物，70 ℃变性5 min，使引物及模板配对。变性后立即置于冰上冷却，再加入RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶，37 ℃反应60 min，95 ℃灭活5 min，将RT产物置于 -20 ℃ 冰箱中保存。

1.4.3PCR引物设计根据GenBank上牛的基因引物序列，用Primer 5.0软件设计PCR引物（表2）。表2PCR扩增引物参数

基因引物序列来源大小

（bp）退火温度

（℃）18S rRNA正向：5′-CGGACATCTAAGGGCATCA-3′；反向：5′-AAGACGGACCAGAGCGAAA-3′DQ222453.153858Cyclin D1正向：5′-CCTGCCGTCCATGCGGAA-3′；反向：5′-GAACTTCACATCTGTGGCAC-3′NM_001046273.143060Cyclin A正向：5′-ACAGTATGAGGGCTATCC-3′；反向：5′-TGTGGTGCTCTGAGGTAG-3′NM_001075123.158658CDK2正向：5′-GCTTTCTGCCACTCTCAT-3′；反向：5′-GCTCCGTCCATCTTCATC-3′NM_001014934.143858CDK4正向：5′-CGTTGGCTGTATCTTTGC-3′；反向：5′-GATTCGCTTGTGTGGGTT-3′NM_001037594.125658CDK6正向：5′-GCAGTATGAGTGCGTGG-3′；反向：5′-TTATGGTTTCAGTGGGC-3′XM_58915133552

1.4.4PCR扩增将所有待测RT产物的等比例混合样对反应条件及循环圈数进行优化。PCR反应体积为25 μL，包括2 μL上、下游引物（其中18S rRNA引物为0.12 μmol/L，其他目的基因引物为0.6 μmol/L），2 μL RT产物，0.1 μL（1 U）Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer（含100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl、1.0% Triton X-100），0.8 μL 0.32 mmol/L dNTP，1.8 μL MgCl2。PCR反应条件为： 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，52～60 ℃复性35 s，72 ℃延伸40 s，重复32个循环；72 ℃延伸10 min。同时用ddH2O、RNA样品分别取代RT产物作为对照，以检验是否有外源性、基因组DNA污染。

1.4.5电泳及结果分析PCR反应结束后，取18 μL PCR产物与2 μL 10 ×上样Buffer混匀后上样于2%琼脂糖凝胶中（含0.1 μg/mL溴化乙锭）。在1×TAE电泳缓冲液中100 V电压下电泳30 min，采用Marker DL2000同时电泳作为DNA标准分子量，采用Kodak 1D图像分析系统观察并分析结果。

1.5Real-time Q-PCR法检测山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4 mRNA表达

以18S rRNA为内标基因，用荧光实时定量PCR（Real-time Q-PCR）进行相对定量。根据GenBank上的牛的基因引物序列，应用Primer 5.0软件设计引物。Cyclin D1基因编号为EU525165.1，正向：5′-TTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向：5′-CCACCACCCTGTTACTGTT-3′。CDK4基因编号为NM_001127269.1，正向：5′-TGAGCATCCCAGTGTTGT-3′，反向：5′-CCTTGTCCAGATACTTCCT-3′。18S rRNA基因编号为DQ222453，正向：5′-GAAACGGCTACCACATCC-3′，反向：5′-ACCAGACTTGCCCTCC-3′。反应体积20 μL，包括 2 μL RT产物，2 μL上、下游引物，1× iQ SYBR Green supermix。用所有待测RT产物的混合样（每份待测样品等体积混合）对反应条件进行优化。反应条件为：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，重复40个循环。通过熔点曲线判断是否有非特异性扩增产物或引物二聚体出现，单一产物的熔点曲线只有1个单一峰，没有杂峰，也不出现主峰的异常增宽。采用2-ΔΔCt法分析数据。ΔΔCt计算公式如下。

1.6Western Blot检测山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4含量

1.6.1样品蛋白的提取参照试剂盒说明书提取瘤胃上皮组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，分装后置于-80 ℃保存。

1.6.2变性电泳取50 μg蛋白样品与6×SDS上样缓冲液按5 ∶1（体积比）混合均匀，100 ℃煮沸5 min，自然冷却后加样，5%浓缩胶、10%分离胶分别在80、100 V恒压下电泳至溴酚蓝前沿移动至凝胶底部。

1.6.3转印电泳结束后，将凝胶上的蛋白用半干转印仪转印到PVDF膜上，转印条件为电流1 mA/cm2，反应时间为40 min。

1.6.4封闭、抗体孵育转印完毕后，取出PVDF膜，置于含有5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h。封闭完成后用TBST清洗PVDF膜上多余的奶粉，一抗（Cyclin D1和CDK4 1 ∶1 000 TBST稀释，GAPDH 1 ∶5 000 TBST稀释）中4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤后，继续在二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG，1 ∶6 000 TBST稀释）中室温孵育1 h。

1.6.5发光、照相TBST充分洗涤后加入化学发光液，暗室曝光、显影、定影，在胶片上获得相应的蛋白条带。

1.7数据处理

用Kodak 1D凝胶图像分析系统对条带进行光密度测定，以目的条带与GAPDH条带的光密度比值代表目的条带表达的相对水平。结果以平均数±标准误表示。采用SPSS 13.0软件分析数据。

2结果与分析

2.1日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响HL组山羊瘤胃上皮细胞S期、G2/M期细胞百分率均显著高于LL组，G0/G1期细胞百分率显著低于LL组。由此可知，高能量日粮能加速山羊瘤胃上皮细胞周期G1期进程，促进细胞增殖。

日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响

组别细胞百分率（%）G0/G1期S期G2/M期低能量组（LL）89.19±1.319.09±1.441.72±0.39高能量组（HL）81.16±1.24*14.96±1.33*3.87±0.65*注：“*”表示与LL组相比差异显著，各期细胞百分率测定以检测10 000个细胞为基准。

2.2细胞周期蛋白和蛋白激酶基因在山羊瘤胃上皮的表达

Cyclin D1、Cyclin A、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA 在山羊瘤胃上皮均有表达。

2.3日粮能量水平对山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA和蛋白表达的影响

HL组山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA表达水平显著高于LL组。由图3可知，Western Blot法检测出 Cyclin D1蛋白在山羊瘤胃上皮均有表达。HL组山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表达水平显著高于LL组。由此可知，高能量日粮能促进山羊瘤胃上皮G1期细胞周期调节蛋白Cyclin D1蛋白表达。

2.4日粮能量水平对山羊瘤胃上皮CDK4 mRNA、蛋白表达的影响

CDK4 mRNA表达水平在HL组与LL组之间差异不显著。由图5可知，Western Blot法检测出CDK4蛋白在山羊瘤胃上皮表达。HL组山羊瘤胃上皮CDK4蛋白表达水平显著高于LL组。由此可知，高能量日粮通过促进山羊瘤胃上皮Cyclin D1-CDK4复合物形成，推动G1期细胞进入S期。

3结论与讨论

高能量饲料能促进青年奶牛瘤胃乳头生长[3-4]。Stobo等研究表明，与粗料相比，高能量精料能促进犊牛体重增加，提高瘤胃挥发性脂肪酸浓度，刺激瘤胃上皮乳头增大[5]。研究表明，高能量日粮能促进多种反刍动物，包括山羊、绵羊、牛的瘤胃上皮乳头生长[6-9]。测定动物机体及其器官生长最经典的表观指标是质量。器官质量的改变可通过细胞数量性增生或细胞肥大完成。细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂完成所经历的整个有序过程称为细胞周期。完成1次细胞周期后，1个母细胞分裂为2个子细胞。细胞周期由G1期（生长期，DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有丝分裂期）多个环节组成。本研究发现，高能量日粮山羊瘤胃上皮细胞G1期细胞百分率降低，S期、G2/M期细胞百分率升高，说明高能量日粮能加速山羊瘤胃上皮细胞G1期进程，推动细胞从G1期进入S期、G2/M期，从而加速细胞周期运转，促进细胞增殖。细胞周期进程受到细胞周期蛋白（Cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）复合物的调节。每种Cyclin与相应CDK装配形成具有全酶活性Cyclin-CDK复合物，通过底物磷酸化作用确保细胞周期各个阶段顺利运行。Cyclin D-CDK4/6复合物、Cyclin E-CDK2复合物调节细胞周期G1期的进程[10]。Cyclin A-CDK2复合物调节细胞周期S期进程，之后由Cyclin B-CDK1（cdc2）复合物推动G2期、M期运行。本研究表明，Cyclin D1、CDK4 的mRNA及蛋白在山羊瘤胃上皮中均有表达，高能量日粮条件下山羊瘤胃上皮细胞细胞周期G1期进程加快与G1期细胞周期蛋白Cyclin D1及CDK4表达升高有关。Cyclin D1从G1早期开始合成，持续合成并累积至G1中期，与CDK4、CDK6形成Cyclin D1-CDK4/6复合物。G0期、G1早期的Rb蛋白处于低磷酸化水平，Cyclin D1-CDK4复合物磷酸化Rb蛋白的S795位点，释放E2F转录因子[11]。G1晚期在Cyclin E-CDK2参与下，Rb蛋白多个位点（S780、S795、S807、S811）高度磷酸化，释放全部E2F转录因子[12-13]，活化的E2F启动下游细胞周期的进程关键基因转录[14]，从而使细胞周期从G1期顺利进入S期。哺乳动物细胞中G1期细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E的合成受到多种外界因素的调节，日粮能量水平是其中最重要的因素之一。提高日粮能量水平能促进小鼠体重增加、提高复层上皮细胞及肝脏上皮细胞Cyclin D1表达[15]。Kobayashi等给大鼠饲喂不同能量水平日粮，高能量组大鼠前列腺上皮Cyclin D1表达较低能量组显著升高、细胞增殖加快[16]。限制大鼠的日粮能量摄入后，大鼠乳腺上皮细胞Cyclin D1蛋白表达水平下降，其下降幅度与日粮能量降低幅度呈正相关[17]。研究发现，早期肝脏上皮细胞的异常增生、癌变与摄入大量高能量食物有关，饲喂高能量日粮能提高大鼠肝脏上皮细胞Cyclin D1表达，导致细胞增殖加快[18]。研究表明，Cyclin D1、Cyclin E表达升高均能导致细胞周期G1期进程加快。Resnitzky运用转基因技术使大鼠成纤维细胞Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白过表达，结果发现，Cyclin D1、Cyclin E蛋白过表达的未同步化的体外培养大鼠成纤维细胞G1期进程均较对照组显著加快，Cyclin B1过表达则对细胞周期进程无影响，表现为Cyclin D1组、Cyclin E组较对照组G1期细胞百分率降低，S期、G2/M期细胞百分率升高；Cyclin B1组与对照组G1期、S期、G2/M期细胞百分率均无显著差异[19]。研究发现，Cyclin D1异位过表达的大鼠肝脏上皮细胞较正常表达组G1期时间缩短，细胞体积变小[20-21]。研究人员体外用锌处理停滞在G1期的人乳腺上皮细胞，提高Cyclin D1蛋白表达，15 h后33%～38%的细胞进入S期，相反，当Cyclin D1蛋白表达水平下降时，Cyclin D1-CDK4复合物活化水平降低，细胞周期停滞在G1期。据报道，体外添加SJSZ糖蛋白能抑制肝脏上皮细胞Cyclin D1表达，同时提高细胞周期蛋白激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI）p53、p21、p27蛋白表达，抑制Cyclin D1-CDK4活化，进而使其细胞周期停滞在G1期[22]。高能量日粮对大鼠细胞周期的影响也主要作用在G1期[23]。细胞周期G1期的调节由Cyclin D1-CDK4复合物与Cyclin E-CDK2复合物共同完成，但是Cyclin D1-CDK4复合物合成要先于Cyclin E-CDK2复合物。研究发现，Cyclin E的表达依赖于Cyclin D1-CDK4复合物的活化，并且Cyclin D1表达促进Cyclin E的合成。

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