五味子主要有效成分的综合提取方法

程振玉+杨英杰+刘治刚+等

摘要：五味子先经水蒸气蒸馏提取挥发油并收集后，再将水提液与药渣分离，对水提液浓缩后加入乙醇沉淀多糖，对药渣采用超声波-微波辅助乙醇溶液萃取木脂素。结果显示，与未提挥发油而分别直接水提、醇提的五味子比较，该方法所获得的五味子多糖、木脂素类成分含量均未有明显变化。水蒸气蒸馏法能同时提取五味子挥发油和多糖，剩余药渣可作为原料，采用超声波-微波法继续提取木脂素，消耗时间短，溶剂用量小，操作简便。由此可知，该方法能节约资源，降低成本，充分提高药用资源五味子的利用率。

关键词：五味子；挥发油；多糖；木脂素；超声波-微波法；综合提取

中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0273-03

收稿日期：2013-10-08

作者简介：程振玉（1986—），男，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail：844503608@qq.com。

通信作者：杨英杰。E-mail：yanghjm@163.com。五味子是五味子科植物五味子（Schisandra chinensis Baill）的干燥成熟果实，主产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地[1]。五味子具有很高的药用价值，《中华人民共和国药典》（2010年版）中明确指出五味子具有收敛固涩、益气生精、补肾宁心之功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、盗汗、短气脉虚、心悸失眠等症[2-3]。五味子除药用外，还可以作为调味剂和食品添加剂用于炖鱼炖肉、熬汤、熬粥、泡茶、加工酸奶等果汁饮料[4-6]。现代药理研究表明，多糖、挥发油、木脂素[7-9]是五味子的主要活性成分。其中，木脂素尤其是联苯环辛烯类木脂素（其成分包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素）[10]，除了具有保肝降酶、止咳、抗炎消毒作用外，还具有抗氧化、抗衰老、抗癌症、消除疲劳、增强机体免疫力等活性[6，8]，已广泛用于临床治疗。多糖具有与之类似的活性，且对糖尿病有显著的治疗效果。挥发油具有良好的镇咳作用，其效力相当于75%的可待因[11]。五味子醇甲、五味子酯甲等木脂素类成分在传统提取方法中主要采用冷浸法、回流法和渗漉法等，这些方法提取时间长、活性成分提取率低；超声波-微波协同萃取新技术将超声波与微波2种作用相结合，充分利用超声波振动的空化作用和微波的高能作用，克服了常规超声波和微波萃取的不足之处，具有溶剂用量少、提取时间短、提取效率高、操作简单等优点；RP-HPLC分析方法准确、灵敏度高、重现性好。本研究对五味子木脂素的萃取方法进行了改良，建立了超声波-微波协同萃取-高效液相色谱同时检测5种木脂素的方法。关于五味子木脂素、挥发油、多糖提取方面的相关文献报道较多，但是对上述活性物质的提取都是分开进行的，某单一成分提取后的药渣往往被作为废弃物扔掉，严重浪费了五味子的药用资源，因此研究综合利用五味子的意义越来越重要，一种综合提取木脂素、挥发油、多糖的新方法亟需建立。本研究先采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，再将水提液与药渣分离，对水提液进行醇沉，对药渣采用超声波-微波法再次提取。通过将本提取方法与未提油而分别直接水提、醇提五味子的方法进行比较，探讨五味子挥发油、多糖与木脂素综合提取新方法的可行性。

1材料与方法

1.1仪器

P230依利特高效液相色谱仪，EC2000色谱工作站，配UV-230+紫外可见检测器，722型-可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），CW-2000A超声波-微波协同萃取/反应仪（中山大学-上海新拓分析仪器科技有限公司），RT-08多功能粉粹机（荣聪精密科技有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），Allegra 64R离心机（BACKMAN公司），SHZ-D循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂）。

1.2药品及试剂

五味子药材购买于吉林省通化市，产地为长白山地区，经吉林化工学院环境与生物工程学院隋新副教授鉴定为五味子的干燥果实。

对照品五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素来自中国药品生物制品检定所，五味子醇甲、五味子丙素来自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，试验用水为超纯水。

1.3测定项目与方法

1.3.1五味子木脂素含量的测定

1.3.1.1高效液相色谱条件Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。流动相为乙腈（A）和水（B）：0～10 min，40%～55%A；10～20 min，55%～68% A；20～25 min，68%～74% A；25～32 min，74%～75% A；32～37 min，75%～100% A；37～48 min，100%A；48～48.1 min，100%～40%A；48.1～65 min，40%A。检测波长225 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.3.1.2木脂素标准曲线的建立取置于干燥器中48 h以上的各对照品，精确适量称取，分别加甲醇溶解并定容，得到1.023 mg/mL五味子醇甲、1.046 mg/mL五味子酯甲、1.261 mg/mL 五味子甲素、1.104 mg/mL五味子乙素、1.026 mg/mL 五味子丙素单对照品储备液。

分别精确量取各对照品储备液适量，依次配成质量浓度为204.6、209.2、252.2、220.8、205.2 μg/mL的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素混合对照品溶液。先用2倍稀释法连续稀释3次后，再采用5倍稀释法连续稀释2次，得到6个浓度的混合对照品溶液。按照“131”高效液相色谱条件进样，以各木脂素相应的峰面积y为纵坐标、质量浓度x（μg/mL ）为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。表15种木脂素的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和检出限endprint

（μg/mL）五味子醇甲y=97.178x+317.020.999 21.0～204.60.041 50.123 6五味子酯甲y=97.787x+73.3830.999 91.0～209.20.047 60.141 5五味子甲素y=107.48x-427.320.999 91.3～252.20.031 80.098 3五味子乙素y=103.35x-102.400.999 81.1～220.80.029 20.087 9五味子丙素y=106.91x-60.7840.999 81.0～205.20.050 70.152 1

1.3.2五味子多糖含量的测定按照苯酚-硫酸法[12]，以葡萄糖为标准样，在最大吸收波长490 nm处测定吸光度。以吸光度D为纵坐标、葡萄糖浓度C（g/mL）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为D=0.009 9C-0.017 9，决定系数r2=0999 7。

多糖得率=多糖质量药材质量×100%

1.3.3挥发油、多糖与木脂素单一成分提取

1.3.3.1水蒸气蒸馏法提取挥发油五味子粉碎，过120目筛，于 60 ℃下烘干，精确称取一定的量，参照沈文等优化的方法[13]，按料液比1 g ∶5 mL加入蒸馏水，浸泡1 h，水蒸气蒸馏5 h，静置1 h，收集挥发油，加入无水硫酸钠脱水干燥，备用。

1.3.3.2回流法提取多糖五味子粉碎，过120目筛，于60 ℃下烘干，精确称取10.0 g，根据郭志欣等报道的五味子多糖的最佳提取工艺[14]，按照料液比1 g ∶30 mL加入蒸馏水，于100 ℃下回流提取4 h，提取液经离心后收集上清液，用旋转蒸发仪浓缩至1 g ∶2 mL（粉末质量 ∶浓缩液体积），加无水乙醇至体积分数为80%[15]，4 ℃下静置过夜，离心，沉淀用无水乙醇洗涤数次，真空干燥得粗多糖。取适量，用蒸馏水溶解，记为多糖提取液Ⅰ，含量测定结果见图1。

1.3.3.3超声波-微波协同法萃取木脂素五味子粉碎，过120目筛，60 ℃烘干后精确称取10.0 g，通过设计响应面试验对超声波-微波萃取木脂素工艺进行优化，确定按照料液比1 g ∶10 mL加入80%乙醇，在超声波频率、功率分别为40 kHz、50 W条件下，以150 W的微波功率萃取10 min，减压抽滤，烧瓶及药渣添加少量提取溶剂洗涤数次，继续抽滤，合并全部滤液；用旋转蒸发仪浓缩，干燥得木脂素浸膏；精确称取少量木脂素浸膏，用甲醇溶解，配成一定浓度，记为木脂素提取液Ⅰ，取少量过0.22 μm尼龙微孔滤膜，进样20 μL，高效液相色谱检测，木脂素色谱分离图和含量分别见图2-A和表2。

2挥发油与木脂素、多糖综合提取试验

提取挥发油的药渣，60 ℃恒温干燥24 h，重新粉碎直至完全过120目筛，一份加入300 mL蒸馏水，按照“1.3.3.2”节所述方法回流提取结束，加入乙醇沉淀过夜，沉淀用无水乙醇洗涤数次后，取适量配成一定浓度溶液，记为多糖提取液Ⅲ，含量测定结果见图1；另一份加入100 mL 80%乙醇溶液，按照“1.3.3.3”节所述，超声波-微波法协同萃取，干燥得木脂素浸膏，然后取适量用甲醇溶解，取少量过0.22 μm尼龙微孔滤膜，记为木脂素提取液Ⅲ，进样20 μL，高效液相色谱检测，木脂素色谱分离图和含量分别见图2-C和表2。

提油药渣（多糖提取液Ⅲ）中多糖含量仅为0.09%，而从提油药渣分离的水溶液中（多糖提取液Ⅱ）的多糖含量与直接从五味子提取的量（多糖提取液Ⅰ）没有差别，表明水蒸气蒸馏法提取五味子挥发油时，多糖也完全浸出，并且充分溶解到水中，提取油后的药渣几乎不含多糖。因此可以采用先水蒸气蒸馏提取挥发油，然后分离药渣，水提液加入乙醇沉淀，精制多糖。

图2 -D为五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的混合标准样色谱图。从图2 -A、2-B可以看出，直接醇提与提油后的药渣醇提这2种方法所得木脂素色谱分离图非常相近，没有任何峰的缺失，且相同的峰对

应的面积基本相等。从图2-C可以看出，木脂素提取液Ⅱ中只含有极少量的五味子醇甲，五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等其他木脂素类成分都不能检测到。

提油药渣中只有五味子醇甲含量略有降低，其他木脂素的含量都没有明显变化。与原药材的提取率相比，药渣中5种木脂素的含量已经超过95%，表明水蒸气蒸馏法提取挥发油不会造成木脂素类成分的损失，因此可以采取挥发油与木脂素相结合的方法提高五味子资源的利用率。

3结论与讨论

挥发油、多糖和木脂素是五味子的主要活性成分，本研究首次对五味子挥发油提取前后多糖与木脂素含量的变化进行了整体分析。结果显示，挥发油提取后，木脂素类化合物含量没有明显变化，多糖类物质的含量急剧降低。但是，经过对药渣中残留的水溶液进行检测后发现，其中所含的多糖类物质与五味子直接水提的含量没有差别，表明水蒸气蒸馏法提取挥发油时，多糖类物质已经被完全提取出来且转移到水中。由此可知，五味子可以通过水蒸气蒸馏法同时获得多糖和挥发油，剩余残渣作为原料继续提取木脂素，使有效成分得到综合利用。该方法节约了资源，降低了成本，提高了药材的利用率，为以后工业化五味子的综合利用提供了数据支撑。

试验发现，提油的五味子药渣醇提取液中，五味子甲素与五味子乙素之间出现了1个新峰，且面积比较大（相对含量比较高），但是其他木脂素类物质的峰数并没有减少，且面积也未发生显著差异，说明这种物质不是木脂素类成分间异构化造成的，可能是因为水蒸气蒸馏温度高，且时间长，导致热稳定性差的其他类物质结构发生转化而生成，该物质具体的结构和性质有待于后续分离单体，或通过液-质连用技术进一步研究。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草：第6卷[M]. 上海：上海科学技术出版社，1999：1558-1559.endprint

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2009：61.

[3]郑虎占，董泽宏，佘靖. 中药现代研究与应用[M]. 北京：学苑出版社，1997：958.

[4]Yang F J，Ma C H，Yang L，et al. Enrichment and purification of deoxyschizandrin and γ-schizandrin from the extract of Schisandra chinensis fruit by macroporous resins[J]. Molecules，2012，17（3）：3510-3523.

[5]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Preparation of high purity biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra extract by ion exchange resin catalytic transformation combined with macroporous resin separation[J]. Journal of Chromatography B，2011，879（30）：3444-3451.

[6]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Study on ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of biphenyl cyclooctene lignans from the fruit of Schisandra chinensis Baill[J]. Analytica Chimica Acta，2011，689（1）：110-116.

[7]Young P J，Wook Y J，Whan C Y，et al. Antihypertensive effect of gomisin A from Schisandra chinensis on angiotensin Ⅱ-induced hypertension via preservation of nitric oxide bioavailability[J]. Hypertension Research，2012，35（9）：928-934.

[8]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of essential oil and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Baill fruits[J]. Journal of Chromatography a，2011，1218（48）：8573-8580.

[9]Zhao T，Mao G H，Zhang M，et al. Anti-diabetic effects of polysaccharides from ethanol-insoluble residue of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill on alloxan-induced diabetic mice[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2013，29（1）：99-102.

[10]刘淼，张朝晖，潘俊芳，等. 五味子多糖抗变态反应活性新发现[J]. 中成药，2012，34（4）：629-632.

[11]Li X N，Cui H，Song Y Q，et al. Analysis of volatile fractions of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. using GC-MS and chemometric resolution[J]. Phytochemical Analysis，2003，14（1）：23-33.

[12]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[13]沈文，叶正良，郭巧生. 东北不同产地五味子药材品质研究[J]. 中国中药杂志，2010，35（22）：3016-3020.

[14]郭志欣，顾地周，宋宇辉，等. 五味子药渣中多糖提取工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：254-255.

[15]范荣军，任涛，刘成柏，等. 五味子多糖提取工艺的比较研究[J]. 中成药，2008，30（6）：827-831.endprint

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2009：61.

[3]郑虎占，董泽宏，佘靖. 中药现代研究与应用[M]. 北京：学苑出版社，1997：958.

[4]Yang F J，Ma C H，Yang L，et al. Enrichment and purification of deoxyschizandrin and γ-schizandrin from the extract of Schisandra chinensis fruit by macroporous resins[J]. Molecules，2012，17（3）：3510-3523.

[5]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Preparation of high purity biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra extract by ion exchange resin catalytic transformation combined with macroporous resin separation[J]. Journal of Chromatography B，2011，879（30）：3444-3451.

[6]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Study on ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of biphenyl cyclooctene lignans from the fruit of Schisandra chinensis Baill[J]. Analytica Chimica Acta，2011，689（1）：110-116.

[7]Young P J，Wook Y J，Whan C Y，et al. Antihypertensive effect of gomisin A from Schisandra chinensis on angiotensin Ⅱ-induced hypertension via preservation of nitric oxide bioavailability[J]. Hypertension Research，2012，35（9）：928-934.

[8]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of essential oil and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Baill fruits[J]. Journal of Chromatography a，2011，1218（48）：8573-8580.

[9]Zhao T，Mao G H，Zhang M，et al. Anti-diabetic effects of polysaccharides from ethanol-insoluble residue of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill on alloxan-induced diabetic mice[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2013，29（1）：99-102.

[10]刘淼，张朝晖，潘俊芳，等. 五味子多糖抗变态反应活性新发现[J]. 中成药，2012，34（4）：629-632.

[11]Li X N，Cui H，Song Y Q，et al. Analysis of volatile fractions of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. using GC-MS and chemometric resolution[J]. Phytochemical Analysis，2003，14（1）：23-33.

[12]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[13]沈文，叶正良，郭巧生. 东北不同产地五味子药材品质研究[J]. 中国中药杂志，2010，35（22）：3016-3020.

[14]郭志欣，顾地周，宋宇辉，等. 五味子药渣中多糖提取工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：254-255.

[15]范荣军，任涛，刘成柏，等. 五味子多糖提取工艺的比较研究[J]. 中成药，2008，30（6）：827-831.endprint

[2]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：化学工业出版社，2009：61.

[3]郑虎占，董泽宏，佘靖. 中药现代研究与应用[M]. 北京：学苑出版社，1997：958.

[4]Yang F J，Ma C H，Yang L，et al. Enrichment and purification of deoxyschizandrin and γ-schizandrin from the extract of Schisandra chinensis fruit by macroporous resins[J]. Molecules，2012，17（3）：3510-3523.

[5]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Preparation of high purity biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra extract by ion exchange resin catalytic transformation combined with macroporous resin separation[J]. Journal of Chromatography B，2011，879（30）：3444-3451.

[6]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Study on ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of biphenyl cyclooctene lignans from the fruit of Schisandra chinensis Baill[J]. Analytica Chimica Acta，2011，689（1）：110-116.

[7]Young P J，Wook Y J，Whan C Y，et al. Antihypertensive effect of gomisin A from Schisandra chinensis on angiotensin Ⅱ-induced hypertension via preservation of nitric oxide bioavailability[J]. Hypertension Research，2012，35（9）：928-934.

[8]Ma C H，Liu T T，Yang L，et al. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of essential oil and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Baill fruits[J]. Journal of Chromatography a，2011，1218（48）：8573-8580.

[9]Zhao T，Mao G H，Zhang M，et al. Anti-diabetic effects of polysaccharides from ethanol-insoluble residue of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill on alloxan-induced diabetic mice[J]. Chemical Research in Chinese Universities，2013，29（1）：99-102.

[10]刘淼，张朝晖，潘俊芳，等. 五味子多糖抗变态反应活性新发现[J]. 中成药，2012，34（4）：629-632.

[11]Li X N，Cui H，Song Y Q，et al. Analysis of volatile fractions of Schisandra chinensis （Turcz.） Baill. using GC-MS and chemometric resolution[J]. Phytochemical Analysis，2003，14（1）：23-33.

[12]Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry，1956，28（3）：350-356.

[13]沈文，叶正良，郭巧生. 东北不同产地五味子药材品质研究[J]. 中国中药杂志，2010，35（22）：3016-3020.

[14]郭志欣，顾地周，宋宇辉，等. 五味子药渣中多糖提取工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：254-255.

[15]范荣军，任涛，刘成柏，等. 五味子多糖提取工艺的比较研究[J]. 中成药，2008，30（6）：827-831.endprint