抗血管性血友病因子抗体对特发性血栓性血小板减少性紫癜的影响

覃乃辉，裴正玲，周达利，秦 立，黄慧嫔

（1.广西壮族自治区人民医院检验科，南宁 530021；2.广西壮族自治区南宁市第一人民医院检验科 530022）

血栓性血小板减少性紫癜（TTP）是一种罕见的血栓性疾病，其特点是播散性微血管血栓形成导致的血小板减少和微血管性溶血性贫血［1］，并可引起患者多器官功能障碍而严重危及患者的生命。TTP是临床的罕见病，临床上通常根据发病机制分为遗传性、继发性和特发性3种类型，其中，特发性TTP是临床上最常见的类型［2－3］。有研究发现，TTP患者血浆中存在超大分子量的血管性血友病因子（vWF）多聚体，在发病过程中起到至关重要的作用［4］。而以往研究表明，大多数特发性TTP患者vWF多聚体的形成是由于患者血浆中存在抗血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）自身抗体［5－6］。近年来，有学者发现部分特发性TTP患者存在抗血管性血友病因子（vWF）抗体，可能在发病中起到重要的作用［7］。为探讨vWF抗体在特发性TTP发病中的意义，作者进行了相关研究，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择广西壮族自治区人民医院2010年1月至2013年6月收治的特发性TTP患者28例，平均（24.8±7.8）岁；另选同期门诊体检的健康者30例作为健康对照组，平均（25.6±7.2）岁，所有参与研究的人员均对研究知情同意，并经医院伦理委员会审批。

1.2 方法 所有受试者采集外周静脉血5mL，注入枸橼酸钠抗凝，3000r／min离心10min，分离血浆，置于－70℃低温保存集中检测。应用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测受试者血浆ADAMTS13抗原水平，由广西医科大学肿瘤学重点实验室检测，具体方法：应用抗ADAMTS13单克隆抗体2G3（4μg／mL）（试剂盒购自丹麦Dako公司）包被96孔板，4℃过夜，采集50μL患者血浆按1∶4，1∶8，1∶16稀释，加入待测孔，37℃孵育1h，滴加ADAMTS13单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h，加入生物学二抗，辣根过氧化酶GAMHRP（Sigma公司生产）标记，室温孵育1h，应用邻苯二胺显色，1.5mol／L硫酸终止反应，490nm酶标仪读取吸光度值。如待检混合血浆中ADAMTS13活性较正常血浆的混合血浆ADAMTS13活性下降50%以上，表示待检血浆中存在抑制物。vWF抗体检测采用ELISA法（试剂盒购自丹麦Dako公司），酶标仪读取490nm条件下反应物吸光度A值，如检测值高于x±2s则判定为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TTP患者vWF抗体检测结果 28例特发性TTP患者中有3例患者vWF抗体阳性（vWF抗体阳性组），其余患者vWF抗体阴性（vWF抗体阴性组）。vWF抗体阳性组ADAMTS13抗体均为阴性，ADAMTS13含量均低于正常值，见表1。

表1 3例vWF抗体阳性TTP患者检测结果

2.2 3组ADAMTS13抗原和vWF抗体检测情况 将所有受试者检测结果分析，vWF抗体阳性组（3例，4份血浆）血浆ADAMTS13含量为（73.88±35.52）mU／mL，vWF抗体阴性组（25例，32份血浆）血浆 ADAMTS13含量为（102.71±38.66）mU／mL，健康对照组（30例，30份血浆）血浆 ADAMTS13含量为（528.78±185.66）mU／mL，vWF抗体阳性组血浆ADAMTS13含量明显低于vWF抗体阴性组和健康对照组，3组血浆ADAMTS13含量差异有统计学意义（P＜0.01）。vWF抗体阳性组患者血浆vWF抗体A值明显高于vWF抗体阴性组和健康对照组（P＜0.01），见表2。

2.3 28例特发性TTP血浆置换（PE）前后血浆ADAMTS13抗原和vWF抗体水平检测 28例患者中23例采取PE治疗，其中，17例经过2次PE治疗，6例经过1次PE治疗，PE治疗后血浆ADAMTS13抗原明显升高，vWF抗体A值明显降低（P＜0.05），见表3。

表2 3组血浆ADAMTS13抗原和vWF抗体检测情况

表3 28例特发性TTP PE前后ACMTS13抗原和vWF抗体水平

3 讨 论

TTP是一种罕见的血栓性疾病，多年以来，临床上诊断TTP主要依赖于“五联征”和溶血、血栓等实验指标，给其诊断和治疗带来了一定的困难［8］。直到1998年，Furlan等［9］研究发现TTP患者血浆中ADAMTS13活性严重缺乏，给TTP发病机制的研究带来了新的方向。研究证实，TTP患者血浆ADAMTS13缺乏主要是由于患者ADAMTS13基因突变或抗ADAMTS13自身抗体引起［10］。目前，血浆ADAMTS13缺乏在TTP发病中的作用已经得到广大学者的认同［11］。有报道表明，特发性TTP患者中血浆ADAMTS13活性严重缺乏的发生率为33%～100%，平均为75%［12］。然而，仍有1／4的TTP患者血浆ADAMTS13活性正常或仅轻度降低，而4%～62%的特发性TTP患者也未发现抗ADAMTS13自身抗体［13］。

近年来，有研究发现，TTP患者血浆中存在超大分子量的vWF多聚体，在发病过程中起到至关重要的作用［14］。而部分特发性TTP患者存在vWF抗体，可能在发病中起到重要的作用。Bonnefoy等［15］认为，TTP患者vWF抗体与vWF形成复合物，是诱导患者血小板自发性聚集的原因之一。本研究对28例特发性TTP患者血浆ADAMTS13和vWF相关指标进行了检验，结果发现3例TTP患者vWF抗体阳性。这3例患者血浆中均存在vWF多聚体，但抗ADAMTS13为阴性。vWF Ag、vWF CB和vWF Rcof均正常，基本可以排除获得性血管性血友病。进一步分析发现，vWF抗体阳性组、vWF抗体阴性组血浆ADAMTS13含量均明显低于健康对照组，证实了TTP患者血浆ADAMTS13活性严重缺乏。而vWF抗体阳性组血浆ADAMTS13含量明显低于vWF抗体阴性组，提示vWF抗体可能对抗ADAMTS13活性，并参与vWF复合物的形成，在特发性TTP发病中起到重要的作用。

为进一步证实以上观点，作者对28例患者PE前后血浆ADAMTS13抗原和vWF抗体水平进行了比较。从结果来看28例特发性TTP经过PE后ADAMTS13抗原明显升高，vWF抗体A值明显降低。目前，PE仍是TTP急性发作的主要治疗方法，该方法可以显著降低患者的病死率，延长患者生存时间。本实验结果提示，通过PE治疗后患者vWF抗体水平明显降低，而血浆ADAMTS13含量得到提高，并可能进一步影响vWF复合物的形成，使疾病得到缓解。

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