产β-甘露聚糖酶菌株的物理和化学诱变育种研究

李慧玲，刘祖艳，赵 敏*

(1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040)

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.l.78)是一种内切水解酶，可以断裂β-1，4-D-甘露糖苷键，其属于半纤维素酶类［1－2］。人们研究β-甘露聚糖酶始于20世纪50年代末60年代初，1958年Courtios［3］等首次发现产β-甘露聚糖酶的真菌;1960 年 Williams和 Doetsch［4］从细菌中得到 β-甘露聚糖酶;1965年Shibata和Reese［5］第1次提出β-甘露聚糖酶的概念。目前β-甘露聚糖酶已经在医药卫生、纸浆漂白、功能低聚糖的研发和石油开采等方面得到广泛应用。

目前对β-甘露聚糖酶产生菌选育的主要手段是通过诱变育种方式进行菌种改良，从而筛选到适应环境能力强、繁殖力高的高产菌株。诱变育种具有操作简便、速度快、效果显著等优点。该研究采用紫外线和甲基磺酸乙酯相结合的诱变方法，提高了β-甘露聚糖酶的活力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株。东北林业大学微生物及免疫学实验室保存菌株Bacillus subtilis WD23。

1.1.2 主要培养基。产酶培养基:魔芋胶30 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 4 g/L，KNO36 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 为 8.0。初筛培养基:魔芋胶 3 g/L，CaCl20.5 g/L，KH2PO40.05 g/L，NaCl 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.025 g/L，KNO30.7 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨5 g/L，琼脂18 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 出发菌株生长曲线的测定。取适量菌体接入LB培养基培养约12 h。取种子液1 ml移入到50 ml LB液体培养基培养，间隔2 h取样测菌液的OD600值，绘制生长曲线。每次测量取3组平行。

1.2.2 出发菌株产酶历程的测定。取适量菌体接入LB培养基培养12 h左右。将600 μl种子液移入魔芋胶产酶培养基培养。间隔2 h取样，用DNS方法测定发酵液中酶的活性。每次测量取3组平行。

1.2.3 酶活测定。采用改进的3，5-二硝基水杨酸法(DNS方法)测定酶活力［6］。

1.2.4 菌株的紫外诱变。将菌体培养至对数生长期的后期，用生理盐水调整菌悬液浓度为108cfu/ml。紫外灯下照射剂量分别为0、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s。用无菌生理盐水稀释诱变菌液和未诱变菌液，涂布于LB固体平板培养基上，37℃倒置培养过夜，计算致死率，致死率=(对照菌液的活菌数－处理菌液的活菌数)/对照菌液的活菌数×100%。随机选取120个诱变后的菌株点种在魔芋胶初筛培养基上，首先测量单菌落直径，再加入刚果红染液染色，测量透明水解圈直径，计算H/C比值。选择H/C比值较高的菌株采用DNS方法进行复筛。

1.2.5 菌株的甲基磺酸乙酯诱变。选择紫外诱变活性最高的菌株进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变。用磷酸缓冲液洗涤菌体，制备菌悬液浓度为108cfu/ml。EMS的使用浓度是1%(V/V)。诱变5、10、15、20、25、30 min。用无菌生理盐水稀释诱变菌液和未诱变菌液，涂布于LB固体平板培养基上，37℃倒置培养过夜，计算致死率，初筛和复筛的方法同紫外诱变。

2 结果与分析

2.1 出发菌株的生长曲线 由图1可看出，在培养初期菌体数量较少，随着培养时间增加菌体数量呈上升趋势，当培养约13 h时菌体数量达到最大值，随后菌体数量开始下降，所以紫外诱变时液体培养时间确定为13 h。

2.2 出发菌株的产酶历程 出发菌株产酶历程如图2所示，发酵初期菌株诱导产酶水平较低，在发酵培养11 h时OD值最高，由于OD值与酶活性成正相关，所以这时酶活力最高。以此确定发酵产酶培养时间为11 h。

图1 B.subtilis WD23生长曲线

2.3 紫外诱变结果

2.3.1 紫外诱变的致死率。根据诱变剂量选择原则，紫外诱变致死率在70% ～80%时，正突变率最高。所以，紫外照射时间选为20～30 s。

2.3.2 初筛和复筛结果。经刚果红染色后，测量水解圈直径和菌落直径，并计算H/C比值，H/C比值大说明降解底物的能力强;菌落直径大说明菌落适宜在该环境中生长。与对照组相比，分别选择20株正突变菌株，进行复筛。DNS方法测定初筛所得的20株突变株，最终获得的酶活最高的正突变菌株为B.subtilis W12(酶活力为3 532.01 U/ml)，出发菌株酶活力为3 248.82 U/ml，紫外诱变使酶活力提高8.72%。

图2 B.subtilis WD23的产酶历程

2.4 甲基磺酸乙酯诱变结果

2.4.1 甲基磺酸乙酯诱变致死率。甲基磺酸乙酯属于化学诱变剂，该研究中诱变剂浓度选为1%。甲基磺酸乙酯对菌体的致死率在70% ～80%之间，正突变率最高，所以菌株B.subtilis W12的甲基磺酸乙酯诱变时间选为10 min。

2.4.2 初筛和复筛结果。在初筛平板选择20株正突变菌株，进行复筛。测定初筛所得的20株突变株，最终得到的酶活最高的突变菌株 B.subtilis WL-12，酶活力为3 577.57 U/ml，甲基磺酸乙酯使酶活力提高了1.29%。

3 讨论

微生物的诱变育种包括物理诱变、化学诱变和生物诱变，其中经常应用的紫外线诱变和甲基磺酸乙酯诱变。紫外线照射可以使DNA形成胸腺嘧啶二聚体，影响DNA正常复制和碱基的正常配对，最终引起基因突变［7］。甲基磺酸乙酯属于烷化剂，碱基烷基化后影响mRNA正常转录，从而使蛋白质表达紊乱而改变性状。该研究中采用了紫外线、甲基磺酸乙酯分别诱变菌株，结果表明紫外线诱变效果好于甲基磺酸乙酯，也就是物理诱变效果好于化学诱变。

［1］MCCLEARY B V.β － mannanase［J］.Methods in Enzymology，1988，160:596－610.

［2］SCHOMBUG D，SALZMANN M.Enzyme Handbook［M］.Berlin:Springer－Verlay Berlin Heideberg，1991:1 －5.

［3］COURTIOS J E，PETEK F，KADA T.Research on galactomannans.II.Action of takadiastase on the galactomannan of lueeren［J］.Bull Soc Chem Biol，1958，40:2031 －2037.

［4］WILLIAMS P P，DOETSCH R N.Microbial dissimilation of galactomannan［J］.Gen Microbiol，1960，22:635 －644.

［5］REESE T，SHIBATA Y.β-Mannanase of fungi［J］.Can J Microbiol，1965，11:167－183.

［6］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959(31):426 －428.

［7］庞晓坤，曹德菊，花日茂.物理因子诱变技术在废水生物处理中的应用研究［J］.四川环境，2005，24(5):68 －71.