响应面法优化短梗五加中刺五加苷B和E的超声提取工艺

史伟国，崔立勇，2，佟 庆，2，袁 寰，吴莉莉，周清波，李 洋

(1.佳木斯大学，黑龙江佳木斯 154007;2.黑龙江省合江林业科学研究所黑龙江佳木斯 154002)

短梗五加(Eleutherococcus sessiliflorus)，又名无梗五加，为五加科五加属(Eleutherococcus)多年生落叶植物［1］。近年来，随着刺五加药用的发展，野生资源出现相对紧缺的状况，短梗五加的药用价值越来越得到人们的重视。研究表明，短梗五加短梗五加中含有大量的苷类物质，其中刺五加苷B、E为主要的活性成分［2］。刺五加苷E是具有明显的抗应激反应的作用，有抗炎、抗疲劳、抗菌、抗氧化、降血糖、保肝等多种生物活性［3－4］。因此，笔者采用高效液相色谱法对短梗五加茎皮中的刺五加苷B和刺五加苷E的含量进行测定，并应用响应面法优化刺五加苷B、E的提取条件，以期为刺五加苷B、E的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。短梗五加，采于双鸭山市岭东苗圃，经鉴定为五加科五加属(Eleutherococcus)多年生落叶植物。

1.1.2 主要仪器。Agilent 1100高效液相色谱仪，购自Agilent公司;KQ-500DE型数控超声清洗器，购自昆山超声仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发器，购自上海亚荣生化仪器厂。

1.1.3 主要试剂。刺五加苷B、E对照品，购自上海源叶生物科技有限公司，苷B批号:20130724，苷E批号:20130729;所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 短梗五加刺五加苷B、E含量测定。刺五加苷B、刺五加苷E的测定参考文献［5－9］(HPLC法测定刺五加不同部位刺五加苷B、E含量)的方法获得标准曲线的回归方程。

1.2.2 响应面法试验。在单因素试验基础上选取料液比、提取时间和甲醇浓度3因素，采用响应面法试验设计优化刺五加苷 B、E 的甲醇超声提取工艺参数［10－11］。精密称取3.000 g短梗五加粉末，按试验方案中的条件甲醇超声提取2次，取上清液旋转蒸干加甲醇定容，采用高效液相色谱法测定刺五加苷B、刺五加苷E的得率。

表1 刺五加苷B、E提取响应面法试验因素水平设计

2 结果与分析

2.1 线性关系的考察 由表2可知，刺五加苷B、刺五加苷E在各自的质量浓度范围内线性关系良好。

表2 刺五加苷B、E的HPLC标准曲线的回归方程

2.2 回归方程的建立及统计检验 将所得试验数据使用Design-Expert7.1.3 软件分析，得到刺五加苷 B(1)、E(2)的二元多次回归方程为:

由回归方程可见，失拟项不显著(P＜0.05)，说明未知因素对试验结果干扰很小。刺五加苷B的拟合检验极显著(P＜0.01)，刺五加苷E的拟合检验显著(P＜0.05)，同时苷B的R2=0.982 4，苷E的R2=0.897 2，说明模型拟合程度很好，所以所得的回归方程能较好的分析刺五加苷B、E提取得率随各参数的变化规律。

2.3 刺五加苷B、E提取的响应面分析 根据刺五加苷B、E的响应面的3维图分析3个因素对苷B和苷E得率的影响(图1)。图1(A)表明，刺五加苷B得率与甲醇浓度为2次抛物线关系，在45%～50%范围内出现峰值。刺五加苷B得率随料液比的增加显著增加(P＜0.05)，呈上升趋势。图1(B)表明，提取时间对刺五加苷B得率的影响，变化趋势受甲醇浓度的交互作用影响。图1(C)表明，料液比对刺五加苷得率的影响，当提取时间一定时，刺五加苷B得率随着料液比的增加而增加，呈直线上升趋势。

图2(A)表明，刺五加苷E得率随甲醇浓度的升高而增加，随着料液比的增加也显著增加(P＜0.05)，但从价格、能耗等方面考虑，甲醇浓度取40% ～50%，料液比为1∶40时，刺五加苷E得率较高且变化不大。图2(B)表明，在提取时间为70～75 min，料液比1∶35～1∶40时刺五加苷E得率最好。图2(C)表明，刺五加苷E得率随着提取时间的增加先减少后增加，在提取时间为75 min时，甲醇浓度的变化对苷E的得率影响不大。

表3 Box-Behnken试验结果

图1 料液比、甲醇浓度和提取时间对刺五加苷B得率的影响

图2 料液比、甲醇浓度和提取时间对刺五加苷E得率的影响

3 结论

超声提取法与其他的传统提取方法——冷浸法、回流法相比具有提取效率高、耗能少等优点。试验通过单因素试验考察了料液比、甲醇浓度、超声提取时间对刺五加苷B、E的影响。通过响应面分析方法，建立了超声辅助提取短梗五加根茎中刺五加苷B、E的数学模型，回归方程的复相关系数为0.982 4和0.897 5，方程拟合良好。通过响应面分析优化刺五加苷B最佳提取工艺条件为:甲醇浓度为52.46%，超声提取时间75 min，料液比为40 g/ml;刺五加苷E最佳提取工艺条件为:甲醇浓度49.36%，超声提取时间75 min，料液比为40 g/ml。

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