华蟾素对人胆管癌细胞QBC939抑制作用研究

宋艳丽，章 激，曹军华，吴 倩，张玉洁

0 引言

华蟾素注射液(Cinobutacini injection)是我国研发的抗肿瘤中药制剂，为阴干的中华大蟾蜍皮提取加工而制成，其有效成分总称为蟾蜍毒素类，具有清热解毒、利水消肿、化淤溃坚等作用[1]，目前已经成为我国临床上应用较为广泛的抗肿瘤中药制剂之一。已有的研究表明，华蟾素对原发性肝癌、白血病、胰腺癌等效果较好[2-3]，尤其对消化道肿瘤具有较好的疗效。近年来，随着对华蟾素药理学研究的进一步深入，已分离出其主要活性成分为蟾毒内酯类化合物，属强心苷类化合物，包括蟾毒灵(Bufalin)、脂蟾蜍配基(Resibufogenin)、华蟾素毒基(又称华蟾毒精Cinobufagin)等[4]。临床应用以及基础实验研究证实，华蟾素及其含有的活性成分对多种人肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，还可促进凋亡、诱导分化及提高机体免疫功能等。但是，目前国内外对华蟾素抗肿瘤作用具体机制的研究尚不深入，并且其对胆囊癌作用的研究相对较少。因此，本研究从体内和体外观察华蟾素对胆囊癌细胞的抑制作用，及体内对荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影响，以探讨其抗胆囊癌的作用及作用机制，为临床应用提供药理学基础。

1 材料、实验动物和仪器

人胆囊癌QBC939细胞由华中科技大学同济医学院提供；SPF级BALB/C-nu裸鼠，体重16～20 g，购于中国医学科学院上海实验动物繁殖中心，按SPF级要求管理；华蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批号：1204191)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批号：1111031)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培养粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；裸鼠细胞因子酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海森雄科技有限公司)；ELx800型酶联免疫检测仪(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 细胞培养 将胆囊癌QBC939细胞培养在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例传代，每3天传代1次，取对数生长期的细胞用于实验研究。

2.2 MTT法检测华蟾素对人胆囊癌细胞生长的抑制作用 取处于对数生长期的人胆囊癌QBC939细胞，按常规消化和洗涤后制成密度为1×105/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。将溶解于1640培养液的华蟾素注射液分别加入96孔板中，使最终每组含华蟾素浓度分别为10、20、40、80、160、320 μg/mL，每组6个复孔，另设空白对照组。置培养箱培养后分别于24、48、72 h 3个时相各取出一块96孔板，先在倒置显微镜下观察细胞形态学变化，再进行MTT比色实验：每次于实验结束前从各孔中吸出100 μL上清弃去，再加入MTT 10 μL(终浓度为5 mg/mL)，继续培养4 h后，加入DMSO 100 μL/孔，振荡5 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪于波长570 nm处测定各孔吸光度值(A)[5]。按照公式计算不同浓度的华蟾素注射液对QBC939细胞生长的抑制率：抑制率(%)=(阴性对照孔平均A值-药物孔平均A值)/阴性对照孔平均A值×100%，并以剂量和抑制率绘制生长曲线。

2.3 制备模型、分组及给药 取处于对数生长期的人胆囊癌QBC939细胞制成1×107/mL细胞悬液。在无菌条件下，将细胞悬液接种于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，每鼠接种0.2 mL，约3周待肿瘤生长至直径约1 cm左右，以无菌技术取出皮下移植瘤。去除包膜和坏死灶，剪成约1 mm瘤块植入裸鼠的右腋皮下，5～7 d待成瘤后将荷瘤裸鼠随机分为阴性对照组、5-Fu阳性对照组(25 mg/kg)以及华蟾素注射液(25、50、100 mg/kg)3个剂量组，每组10只。正常组每日给予生理盐水灌胃，阳性对照组和华蟾素组均采用腹腔注射的方式给药，每次0.2 mL，皆连续给药12 d。

2.4 检测裸鼠一般状况及进食量 给药期间每日观察裸鼠的活动情况、营养状况和肿瘤生长情况等，并于给药第2天和第9天晚上8∶00分别称取各组饲料的质量W1，次日早晨8∶00称取各组剩余饲料的质量W2，计算裸鼠进食量W=W1-W2。

2.5 检测抑瘤率 取血后，脱颈椎处死裸鼠，剥取瘤块，剔除其他组织后分析天平称取瘤重量。计算各组平均瘤块重量及抑瘤率。肿瘤抑制率(%)=[1-(治疗组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)]×100%。

2.6 检测血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1水平 处死裸鼠前，眼眶静脉丛采血，离心取上清分装于EP管中。按照检测试剂盒说明书采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测TNF-α的含量。建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔加入样品稀释液100 μL，第1孔加标准品100 μL，混匀后吸出100 μL移至第2孔。如此反复做对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔吸出100 μL弃去，第8孔为空白对照。待测样品孔加入裸鼠血清100 μL，将板置37 ℃反应120 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，用吸水纸拍干。每孔加入第一抗体工作液100 μL，使充分混匀后置37 ℃反应60 min。用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，加入酶标抗体工作液100 μL，37 ℃反应60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应5～10 min，再加入50 μL终止液混匀，酶联免疫检测仪于490 nm处测吸光度，绘制标准曲线，并计算TNF-α含量。本实验OD值的高低和细胞因子表达成正比。同法检测并计算IL-6和sVCAM-1的含量。

3 结果

3.1 细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察可见对照组细胞生长良好，细胞呈圆形，形态均一，细胞间连接紧密。经过不同浓度华蟾素作用后的细胞出现皱缩等形态学改变，且随着药物浓度的增加，细胞密度逐渐减少，随着作用时间的延长，上述变化更加明显。结果见图1。

3.2 对QBC939细胞生长的抑制作用 MTT实验结果显示，不同浓度的华蟾素注射液体外均可抑制QBC939细胞的增殖，各药物浓度组细胞生长抑制率与同时间点对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且随作用时间的延长，与同浓度组比较抑制率上升，因此，可见华蟾素注射液体外对QBC939细胞的生长具有抑制作用，这种抑制作用具有浓度和时间依赖性。见图2。

图1 华蟾素注射液对QBC939细胞生长状况的影响

3.3 对荷瘤裸鼠一般状况及进食量的影响 给药期间观察荷瘤裸鼠的一般状况，发现荷瘤对照组裸鼠肿瘤增大，并逐渐表现出状态欠佳、懒惰、喜静、活动迟缓等症状，给药组裸鼠肿瘤增大趋势不及荷瘤对照组，行动同样迟缓，但活动量稍多于荷瘤对照组。实验结果显示，荷瘤对照组裸鼠的进食量减少，9 d时更明显；华蟾素腹腔注射给药皆可不同程度增加荷瘤裸鼠进食量，9 d时更加明显，其中高剂量组增加量最多，提示华蟾素可改善裸鼠一般状况和进食量，并具有浓度依赖性，与模型组相比差异无统计学意义。具体结果见表1。

图2 华蟾素注射液体外对QBC939细胞增殖的抑制作用

表1 华蟾素注射液对荷瘤裸鼠进食量的影响(n=10)

3.4 对荷瘤裸鼠瘤质量的影响 实验结果显示，给药12 d后，5-Fu(25 mg/kg)可明显抑制荷瘤裸鼠的瘤质量的增长，与模型组比较具有显著差异(P<0.001)；华蟾素3个剂量组(25、50、100 mg/kg)皆可不同程度抑制荷瘤裸鼠瘤质量的增加，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，随着剂量的增加，抑瘤率也增大。见表2。

表2 华蟾素注射液对荷瘤裸鼠瘤质量的影响

3.5 对荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影响 与模型组比较，5-Fu(25 mg/kg)能够提高荷瘤裸鼠血清TNF-α含量(P<0.05)，降低sVCAM-1含量(P<0.01)；高、中剂量的华蟾素组裸鼠血清IL-6水平下降(P<0.05)，TNF-α含量升高(P<0.05)；三个剂量组的华蟾素均能降低裸鼠血清sVCAM-1含量(P<0.01，P<0.05)。见表3。

表3 华蟾素注射液对荷瘤裸鼠血清IL-6、sVCAM-1和TNF-α含量的影响

4 讨论

胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，占消化道恶性肿瘤发病率的第5位，胆囊癌发病隐匿，恶性程度高，早期无特殊的临床症状。虽然胆囊癌的手术治疗经历了百年多的历史，但国内外资料表明仍未取得突破性进展，疗效不尽人意，目前在确诊胆囊癌的患者中仅有约30%能获得根治性切除[6]，除了手术以外主要的治疗方法是放疗和化疗。由于缺乏特异的症状和体征，胆囊癌早期诊断率低，就诊的晚期病例难以根治、预后差。目前的常规化疗药物对胆囊癌的治疗效果较差，不能提高胆囊癌患者的生活质量[7]。因此，国内外许多学者试图从天然药物中寻找能有效抑制恶性肿瘤细胞增殖的药物或其活性成分用于治疗胆囊癌。

蟾蜍入药早在唐宋时代就有记载，临床常用于恶疮、肿瘤、水肿等。华蟾素注射液是以传统中药材中华大蟾蜍皮为主要原料制成的一种水溶性制剂，目前已经广泛应用于临床[8]。现代药理学研究表明其有一定的抗肿瘤作用，大量的临床和实验研究证实华蟾素注射液是安全、有效的抗肿瘤制剂[9-10]。体内外实验研究表明，华蟾素及其活性成分蟾毒灵、脂蟾蜍配基等对白血病、胰腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤均有一定的作用[11-12]，其选择性作用较强，对正常组织和细胞无杀伤作用，在抗肿瘤治疗方面有巨大潜力，但是关于其作用于胆囊癌细胞的基础研究报道尚少。

裸鼠异种移植瘤模型是人们进行肿瘤实验性治疗广泛采用的研究手段。本研究采用MTT法检测华蟾素注射液体外对人胆囊癌QBC939细胞生长的影响，以及体内对建立的QBC939细胞裸鼠异种移植瘤行腹腔注射方式给药，实验发现，华蟾素体内外均可有效杀伤人胆囊癌细胞QBC939，明显抑制其增殖，与对照组比较差异有统计学意义，浓度越高，抑制作用越强，且随着作用时间的延长，抑制作用也增强；倒置显微镜下观察还发现，经华蟾素处理过的肿瘤细胞出现皱缩等形态学改变，且随着浓度和时间的增加，细胞密度逐渐减少。提示华蟾素注射液具有明显的抗胆囊癌活性，且作用呈现剂量依赖性。

IL-6是一种多功能生物活性多肽，可由巨噬细胞、成纤维细胞等分泌，也可由肿瘤细胞旁分泌和自分泌产生。IL-6在肝癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌等多种恶性疾病中高表达，促进癌细胞的侵袭和转移，其高表达往往提示肿瘤患者一般情况较差，预后不良[13-14]。TNF-α属肿瘤坏死因子家族，由单核-巨噬细胞、NK细胞、T细胞分泌，它对肿瘤细胞有直接杀伤作用而对正常细胞无明显毒性，在体内也可通过对肿瘤血管的促凝作用，使肿瘤缺血坏死，还可诱导许多不同来源肿瘤细胞凋亡，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，血中TNF-α含量可反映机体抗肿瘤免疫状态[15-16]。本实验发现，华蟾素能抑制裸鼠血清IL-6的表达，促进TNF-α的表达，作用具有剂量依赖性，与模型组相比，皆具有显著性差异(P<0.01)，且具有剂量依赖性，这对防癌、抗癌以及抗肿瘤转移皆具有重要意义。

sVCAM-1是黏附分子免疫球蛋白超基因家族的成员，可参与多种生理、病理反应。近年来研究发现，sVCAM-1在多种肿瘤中存在异常表达，并与肿瘤的恶性临床表现有一定关系[17]。在早期或亚临床期恶性肿瘤患者中，血清sVCAM-1水平异常升高，而将肿瘤进行手术切除以后，sVCAM-1水平可迅速下降[18]。本实验发现，华蟾素各浓度均可以抑制裸鼠血清sVCAM-1的表达，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，但是sVCAM-1水平与华蟾素剂量之间的关系不明显，说明华蟾素对血清sVCAM-1的影响无剂量依赖性，还需进一步探讨。

发现新型抗肿瘤活性高、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤治疗领域需要解决的重要任务。本实验表明，华蟾素体内外均可抑制胆囊癌的生长，裸鼠体内抑瘤作用机制可能与裸鼠血清IL-6和sVCAM-1等细胞因子水平下调及TNF-α水平上调有关，这为临床应用华蟾素治疗胆囊癌提供了一定的理论依据，但是机体肿瘤的形成和发展过程极其复杂，在治疗中仅依靠华蟾素难以取得有效的成果，若将其与放化疗联合使用，能否有效控制胆囊癌生长，减少耐药性，值得进一步研究。

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