电泳技术及其临床应用

胡志成，孟薇薇，戴荣继

（北京理工大学，北京 100081）

电泳（Electrophoresis, EP）是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒，在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。1937年，瑞典科学家Tiselius首先设计出第一台电泳仪，在此基础上建立研究蛋白质分离的“自由界面电泳法（moving boundary electrophoresis）”，开创电泳技术研究的新纪元。此后，电泳技术迅速发展，各种电泳技术及相关仪器相继问世。电泳已广泛地应用于分析化学、生物化学、药理学、微生物学、食品化学等各个领域，在生物化学研究中占有重要地位。

1 电泳的分类

按照分离原理，电泳可分为移动界面电泳、区带电泳、等速电泳及等点聚焦电泳四大类。

1.1 移动界面电泳

移动界面电泳是不含支持物的电泳，溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电泳（Free Electrophoresis）。1937年Tiselius成功地研制了界面电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在一U型管的自由溶液中进行，电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白，α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白五种[1]。该法可以确定带电物质的迁移率，并且能用来研究混合物的组成成分，但是它不适用于研究低分子量的物质，主要用于蛋白质系统等生物大分子的研究方面。虽然它曾取得过很大的发展，但是由于设备复杂，操作时间很长，不能完全地分离混合物的各个组成等一些不可克服的缺点，已逐渐被其他电泳所代替。

1.2 区带电泳

区带电泳（Zone Electrophoresis）是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上电泳分离成若干区带。又称电色谱法，或区域离子电泳。支持介质有多种，如滤纸、醋酸纤维膜、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。通常在缓冲液润湿的介质中产生电场，使不同的带电粒子以一定速率向一定方向移动，使样品组分得到分离。分离后的各组分固定在支持介质上，通过染色可显示出不同的组分。

1.2.1 纸电泳

纸电泳法（Paper Electrophoresis）于20 世纪50 年代逐渐发展起来，是以滤纸作为电泳的支持介质的一种方法。纸电泳法采用的设备简单，应用广泛。最初用于蛋白质，后来也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物质，其优点在于采用滤纸与色素结合的直接电泳图，或剪下滤纸的任何部分来抽提其中的物质。在早期的生物化学研究中，纸电泳技术曾发挥重要作用。由于纸电泳消耗时间长，分辨率较差，近年来逐渐被其它更简便快速、分辨率高的电泳技术所代替。

1.2.2 醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis）是以醋酸纤维薄膜为支持物，于20世纪50年代发展起来的电泳技术。该方法具有以下优点：①对蛋白质样品吸附少，无“拖尾”现象；②分离速度快，电泳时间短；③灵敏度高，样品用量少；④醋酸纤维薄膜染色后背景能完全脱色，各蛋白质染色带分离清晰，从而提高测定的精确性。但由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，必须在密闭的容器中进行电泳，并使用较低压电流避免蒸发。目前醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨率比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点[2]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

20世纪60年代，聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）得到发展。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前能根据分子大小和净电荷多少这两种物理性质差别来分离分子的较好方法。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。由于凝胶的孔径大小可根据待分离样品物质分子的大小来确定，故有较高的分辨率。它除了能作定性、定量分析外，还可以用来测定分子量。

1.3 等电点聚焦电泳

等电点聚焦（Isoelectric FocusingElectrophoresis，IEF）是于20世纪60年代中期出现的技术。该方法利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

等电点聚焦克服了一般电泳易扩散的缺点。近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。由于它的操作简便迅速、分辨力高、重复性好、样品容量大，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

1.4 等速电泳

等速电泳（Isotachophoresis）是20世纪70年代初在普通自由界面电泳的基础上发展起来的一种新新的高效电泳技术，是一种用于分离具有不同净电荷数的分子的方法。等速电泳是在样品中加入一种高迁移率离子（其迁移率比被分离离子大）和一种低迁移率离子（其迁移率比被分离的离子小），样品加在高迁移率离子和低迁移率离子之间，在外电场作用下，使不同离子进行移动。经过电泳后，达到完全分离。被分离的不同离子的区带按迁移率大小依次排列在高迁移率离子与低迁移率离子的区带之间。它可以在一个水平的或垂直的平面上进行（取决于所用仪器）。进行分离的溶液一般是含水的介质。在具体的操作方法上，等速电泳可分为制备型和毛细管型。前者可用于毫克量范围内样品的分离分析；后者则可用于微克量范围内样品的定量分析[3]。等速电泳具有高灵敏度、高分辨率、重现性好及消耗时间短等优点。

2 电泳技术的临床应用

随着电泳技术的相继出现，各种电泳分析仪被引入临床实验室，并在临床疾病的诊断中发挥越来越重要的作用，为各种蛋白质的检测及其对各种疾病的反应提供新的手段和依据。

2.1 血清蛋白电泳

人血浆中含有许多中蛋白质，这些蛋白质在正常成人体内分布均匀程度极高，而当人处在疾病状态时，血浆中蛋白组分含量会发生较大的变化[4]。根据不同血清蛋白具有不同的表面电荷，根据电泳能够对蛋白进行有效的分离，并分析蛋白含量的变化，从而反映患者的身体状态。

1937年，Tiselius提出血清蛋白的电泳分离方法，成功将血清蛋白分离得到五种蛋白。但是由于其分离效果不显著，灵敏度较低，且耗费大，在临床应用上受到较大的限制。随着科技的发展，电泳技术愈加成熟，出现了灵敏度高，操作简单的电泳技术，并被应用于临床检测上。醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。新鲜血清经电泳分析后，可以准确地描绘出病患蛋白质的全貌。一般是白蛋白含量的降低，某个球蛋白区域发生升高或降低，从而反映患者的身体状态。

血清含有各种蛋白质，其等电点均在pH7.5以下，若置于pH8以上的缓冲液电泳时均游离成负离子，向正极移动。由于其等电点，分子量和分子形状各不相同，其电泳速度不同。按其游动速度顺序把血清蛋白粗略分为清蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白。临床上血清白蛋白的减少与γ球蛋白增高为肝病患者血清蛋白电泳所共有的现象，其减少与增加的程度和肝炎的损伤的范围相并行。急性炎症时，可见α1、α2区百分率升高；肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降，α2球蛋白升高，β球蛋白也升高；缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高[5]。

此外，血清蛋白电泳检测在非霍奇金淋巴瘤（nonhodgkin’s lymphoma，NHL）的临床诊断上也具有一定意义。非霍奇金淋巴瘤是一组常见的血液系统恶性肿瘤，大部分为B细胞。NHL已发生早期远处扩散，有的病例在临床确诊时已播散至全身。温冠辉等[6]使用毛细管电泳，分离出的正常血清蛋白电泳可以分为6条区带即：清蛋白带、α1区带、α2区带、β1区带、β2区带及γ区带。NHL患者血清蛋白电泳结果显示，α1区结果显著升高，α2区及格过明显升高，β1区结果显著降低，而清蛋白、β2、γ区带蛋白结果变化不明显。通过血清蛋白电泳，观察各蛋白区带结果变化，可能对NHL的诊断提供一定参考。

因此，通过电泳技术分析血清蛋白的变化，对疾病诊断和预后的评估具有重要的临床意义。

2.2 尿蛋白电泳

肾小球疾病是引起肾功能衰竭的主要原因。在正常生理情况下，由于孔径屏障、电荷屏障及球内系膜组成的肾小球滤过屏障的作用，尿液中蛋白含量甚微。当肾小球通透性增高或滤膜受损，肾小管重吸收能力减弱，肾或其他组织分泌增加时，即产生蛋白尿。蛋白尿的选择性指数可以描述肾小球对大分子通透性的改变。通过电泳分析尿蛋白的蛋白质组成，可帮助分析蛋白尿性质来源，从而有助于病因诊断和预后判断[7～9]。

尿蛋白电泳的主要目的是在无损伤情况下，协助临床分析判断肾脏病变的程度。尿蛋白电泳取材方便，无创伤性，且敏感度高，这样可以避免进行肾活检，从而减轻病人痛苦。目前主要采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）及用十二磺基磺酸钠-琼脂糖凝胶（SDSAGE）进行非浓缩尿蛋白电泳检测。

尿蛋白与SDS反应，形成带有大量负电荷的复合物，带上的大量负电荷，大大超过了蛋白质原有的电荷，从而掩盖各种蛋白质原有的电荷差异，使得蛋白质的迁移率仅仅反映蛋白质压机相对分子量的差别。通过电泳，将蛋白质按照相对分子量大小顺序，分离出蛋白质区带，从而对蛋白尿进行分型[10]。尿蛋白电泳呈现出的中、高分子蛋白区带主要是反映肾小球病变，而呈现出低分子蛋白区带是反映肾小管病变或溢出性蛋白尿；混合型蛋白尿经过电泳可见到各种区带。尿蛋白对临床症状不明显及轻度蛋白尿患者的病情诊断及肾脏疾病在治疗过程中病情的动态分析也具有很大价值。

此外，尿蛋白电泳在糖尿病肾病的检测应用具有重要的临床意义。糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症之一，是糖尿病人死亡的重要原因。糖尿病肾病发病隐匿，逐渐引起全身的小动脉硬化病变，肾脏为最常受累的靶器官之一，并可累及肾小球和肾小管，在没有治疗干预情况下，微量清蛋白尿患者在七年内有50%进入尿毒症期[11]。而通过非浓缩尿蛋白电泳，可以较直观地了解尿蛋白的组分及肾脏受损部位和程度，对肾损害的早期定位、鉴别诊断、指导治疗及预后判断具有临床价值[12]。

2.3 脑脊液蛋白电泳

中枢神经系统（CNS）炎症与一些中枢神经系统疾病的发生发展密切相关，CNS具有免疫活性，并且与外周免疫系统相互作用。脑脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）检查对中枢神经系统的多种疾病的鉴别诊断、病情观察、指导应用等方面能提供重要依据。中枢神经系统炎症性疾病，颅内和椎管的疾病变化急剧，需要正确的诊断和积极的治疗，而对血脑屏障的完整性评价以及对椎管内和颅内炎性病变的诊断，需要依赖于CSF内相关特征性指标的检验。当疾病发生时一些血清蛋白质成分可以在CSF中出现，在CSF中含量最丰富、检测最容易的蛋白质是白蛋白，其次则是IgG。现阶段临床上诊断中枢神经系统病变主要依靠影像学结合临床分析，但对某些中枢神经系统脱髓鞘病变，如多发性硬化、格林巴氏综合症，早期诊断非常困难，病变早期影像学及常规检查无法诊断，而患者脑脊液中免疫球蛋白IgG增加发生早，脑脊液蛋白电泳IgG形成典型寡克隆区带，是早期诊断重要的、不可少的依据[13～15]。

脑脊液中的寡克隆区带、IgG鞘内合成率的变化也可为诊断神经系统炎性疾病提供依据，二者的联合检测可提高神经系统炎性疾病的诊断阳性率。由于该方法特异性较高，敏感性强，国外学者也将脑脊液寡克隆区带区及IgG鞘内合成率联合检测作为早期诊断多发性硬化的实验室指标[16]。

此外，脑脊液寡克隆区带在神经精神性狼疮早期诊断中具有临床意义。神经精神性狼疮临床诊断困难，有研究显示当系统性红斑狼疮合并神经系统病变时可有脑脊液压力、蛋白、细胞数的增高，还有免疫球蛋白、抗核抗体等改变。而患者脑脊液免疫球蛋白IgG增加发生早，且更具有特异性，脑脊液蛋白电泳IgG形成典型寡克隆区带。脑脊液寡克隆区带是经过免疫固定电泳后在脑脊液泳道中出现的异常条带，可以明确判断中枢神经系统内源性合成免疫球蛋白的存在。且检测结果表明神经精神性狼疮患者较对照组，脑脊液的寡克隆区带阳性率明显升高，从而间接反映中枢神经系统免疫反应过程的强烈程度，对神经精神性狼疮的早期发现提供临床依据[17]。

目前脑脊液蛋白质电泳通常用琼脂糖凝胶或醋酸纤维薄膜作为载体，若采用等电聚焦电泳可提高电泳图谱的分辨率。由于脑脊液中蛋白质含量少，因此在电泳前须将脑脊液标本在高分子聚乙二醇或右旋糖苷透析液中浓缩。近年来应用高效毛细管电泳法进行脑脊液蛋白质电泳分析可进一步提高分辨率且脑脊液标本无需浓缩。

2.4 同工酶电泳

在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。同工酶电泳在临床上被用于同工酶或同工酶亚型的分析。

用琼脂糖凝胶电泳法（Agarose Gel Electrophoresis,AGE）将乳酸脱氢酶同工酶分离，得到5种同工酶区带（LDH1～LDH5）。可用于诊断为急性心肌梗塞（当LDH1＞LDH2）及骨骼肌疾病（LDH5升高）的诊断鉴别。而当恶性肿瘤及肝硬化时，可发现LDH5明显升高，或者在胸腹水电泳中出现一条异常的LDH6区带。

采用琼脂糖凝胶电泳法可分离出三种肌酸激酶（CreatineKinase, CK）同工酶。心肌型肌酸激酶同工酶（CK-MB）是肌酸激酶同工酶中的一种，主要分布于心肌中，可作为心肌梗死的早期血清酶学诊断指标。凝胶电泳分析是鉴定心肌型肌酸激酶同工酶最常用的方法。当在临床中遇到患者血清 CK-MB活性高于正常，且占总心肌型肌酸激酶活性超过 30%时，一般不是心肌损伤所致，可进行同工酶电泳分析，以确定病因和明确诊断[18]。

碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）主要用于肝、胆及骨骼疾病的诊断和鉴别诊断。通过测定ALP总活性及其同工酶对引起ALP活性增高的疾病具有诊断和鉴别诊断的意义[19]。采用琼脂糖凝胶电泳法可对ALP同工酶进行常规快速分析，对疾病的诊断提供依据。

2.5 脂蛋白电泳

脂蛋白电泳主要用于高脂蛋白血症分型，也有助于了解冠心病的血脂状态，更好地指导临床诊疗工作。利用脂蛋白中所含载脂蛋白电荷的不同、颗粒大小不同以及分子量、等电点的不同，通过电泳法将各种脂蛋白分成4大类：乳糜微粒（CM）、前-β脂蛋白、β-脂蛋白和α-脂蛋白，分别相当于超速离心法分离的乳糜微粒、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白(LDL）和高密度脂蛋白（HDL）[20]。

脂质代谢紊乱与冠心病的发生关系密切。低密度脂蛋白和高密度脂蛋白是胆固醇（C）主要的转运体，LDL是冠心病的重要危险因素，HDL冠心病的发生呈负相关。LDL-C/HDL-C比值是冠心病重要危险因子之一，随着比值的增大，冠心病的危险性相应增大。通过琼脂糖凝胶电泳结合酶显色法，将胆固醇脂蛋白分离，分析LDL-C及HDL-C水平，有利于临床做出准确判断，做好冠心病的预防工作，从而降低死亡率[21]。

3 展望

随着时代的进步，电泳技术也不断发展，在各方面的应用也愈加广泛。电泳技术在医学临床上的应用，为各种疾病的诊断及患者病情的动态分析等提供了更为便捷、直观的方法。随着电泳技术的不断改进及发展，电泳技术在临床研究应用与疾病的诊断、鉴别诊断等方面提供更准确、更快捷的分析方法，电泳技术也必将越来越受到临床医学的青睐。

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