白芥子对蛇床子体外经皮渗透的影响

李 洋，杨 丹，赵永伟，王艳宏

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨150040;2.南京海纳医药科技有限公司，南京210009)

白芥子为十字花科植物白芥(Sinapis Alba L.)的干燥成熟种子，味辛，性温，入肺经.具温肺豁痰利气，散结通络止痛之功效[1].白芥子在外治法中常作为引赤发泡药应用.现代实验研究表明白芥子具有成为透皮吸收促进剂的潜质[2－6]，但其发挥促透皮作用的物质基础不是很清楚.蛇床子为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实，具有温肾壮阳、祛风、燥湿及杀虫之效，主治阳痿、宫冷、寒湿滞下和妇人瘙痒等.本实验以蛇床子为研究对象，以氮酮、薄荷油和冰片为对照，试图通过考察白芥子各类组分对蛇床子中蛇床子素体外经皮渗透的影响，以探讨白芥子促透皮作用的物质基础.

1 仪器与材料

仪器:HC－188型透皮吸收实验仪(天津市正通科技有限公司);2695型高效液相色谱仪，2996UV型检测器，Empower工作站(美国 Waters公司);超声波清洗仪(无锡市超声电子设备厂);电子恒温水浴锅(苏州威尔实验用品有限公司).

实验动物:Wistar大鼠，体重(180～220)g，合格证号为P00102004，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供.

2 试剂与药品

白芥子(购自哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司，经鉴定符合《中国药典》(2010年版)规定);蛇床子素对照品(中国药品生物制品检定所，批号:201004);抗坏血酸(广东汕头新宁化工厂);无水乙醚(天津市北方天医化学试剂厂);硫氰酸钾(国药集团化学试剂有限公司);乙酸乙酯(天津富宇精细化工)甲醇(美国迪马公司);0.9%氯化钠注射液(黑龙江省哈尔滨市三联药业有限公司);活性炭(国药集团化学试剂有限公司);卡波姆971(美国Lubrizol公司);三乙醇胺(天津市化学试剂六厂);无水乙醇(天津市化学试剂六厂);冰片(广州基元化工有限公司);薄荷油(郑州中天实验仪器有限公司);脂溶性氮酮(天津市博迪化工有限公司);甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯.

3 方法与结果

3.1 白芥子各类成分的制备

采用水蒸气蒸馏法、多级溶剂萃取法和水提醇沉法等联合应用，建立白芥子各类化学组分的拆分方法，将白芥子的化学成分拆分为:挥发油、脂肪油、芥子苷和黄酮、白芥子碱和芥子多糖5个组分.

将白芥子置5倍量pH值为5的浓度为0.5 mmol/L的抗坏血酸溶液中，于50℃恒温水解3 h，再加4倍量水蒸汽蒸馏得到白芥子挥发油[7]，即芥子油.残渣加适量乙醚于50℃索氏提取，40℃挥干乙醚得到白芥子脂肪油.

将白芥子用乙醚脱脂至完全，残渣用95%乙醇提取，重复提取两次，合并滤液，将滤液浓缩成糖浆状浓缩液，用蒸馏水稀释，加入20%KSCN溶液，乙酸乙酯萃取，水溶液置4℃冰箱，48 h后析出得到芥子碱硫氰酸盐结晶.回收乙酸乙酯液得到白芥子苷和黄酮[8].

取脱脂后的白芥子加25倍量水提取2次，每次2 h，浓缩后加5倍量95%乙醇醇沉后干燥得到白芥子多糖[9].

3.2 蛇床子凝胶的制备

取适量蛇床子，粉碎，加入10倍量95%乙醇回流提取2 h，残渣重复提取2次.合并提取液，减压浓缩回收乙醇，在样品液中加入1.25%的活性炭脱色，抽滤，70℃干燥至恒重，蛇床子提取物.

精密称取卡波姆971基质0.2 g均匀撒于4 mL水中，搅拌均匀，静置12 h使充分溶胀，缓慢滴加三乙醇胺，边加边搅拌，调节pH值至6.5～7，将蛇床子提取物用适量蒸馏水溶解，加入无水乙醇3 mL，加入不同量促渗剂，加水至10 g，将上述组分混合均匀，即得半固体胶状凝胶[10].

3.3 蛇床子中蛇床子素HPLC分析方法的建立

3.3.1 液相色谱条件

色谱柱 Kromasil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm);流动相:甲醇－水(75∶25);柱温:28℃;流速:1 mL/min;测定波长:322 nm.色谱图见图1、2.

图1 蛇床子素对照品

3.3.2 标准曲线的制备

精密称取蛇床子素对照品适量，置25mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含40 μg的对照品溶液.分别精密吸取此对照品溶液 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置5 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤.依次精密吸取以上续滤液各20 μL，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定峰面积.以质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，得蛇床子素线性回归方程为:A=329 99C －4 632.7，R2=0.999 4，表明蛇床子素在0.016 ～0.4 μg/mL 的质量浓度范围内有良好的线性关系.

图2 蛇床子样品

3.3.3 精确度试验

精密吸取蛇床子样品溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，求得RSD值为1.45%(n=6)，表明本方法精密度良好.

3.3.4 稳定性试验

精密吸取蛇床子样品溶液20 μL，分别在0、3、6、12、18、24 h不同时间测定峰面积，求得 RSD 为0.66%(n=5)，表明该溶液在24 h内稳定性良好.

3.4 离体鼠皮的制备

选取体重在(200±20)g的 Wistar大鼠，处死后剪毛，剥离背部皮肤并除去皮下脂肪，剪出适当的大小，用生理盐水浸泡并洗净，再置于生理盐水中冷藏保存，3 d内使用.注意在每次实验前，仔细检查以确定鼠皮的完整性，没有任何破损.

3.5 离体渗透试验

采用改良Franz扩散池，在扩散池的供应室和接受室之间将制好的鼠皮固定(鼠皮的角质层朝向供应室)，并将蛇床子凝胶1 g均匀涂抹在鼠皮表面.以30%乙醇生理盐水液为接受液，水浴温度为(37.0 ±0.5)℃，搅拌子的转速为 200 r/min.分别于2、4、6、8、10、12 h 从接受室吸取 1 mL 样品液，并补充等体积新鲜接受液.样品液过0.45 μm微孔滤膜，精密吸取续滤液20 μL，按上述色谱条件测定接受液中蛇床子素的含量.按下式计算累积渗透量 Qn(μg·cm－2).

其中:Cn为第n个取样点测得的药物质量浓度(μg/mL);Ci为第i个取样点测得的药物质量浓度(μg/mL);V为扩散池接受室的体积(mL);A为渗透面积(cm2);Vi为取样体积(mL);做出以渗透曲线直线部分的累积渗透量∑Q(μg·cm－2)对渗透时间t的线性回归方程，该Q－t方程的斜率即为透皮速率常数 K(μg·cm－2·h－1).

3.6 白芥子各类成分及不同促进剂对蛇床子素凝胶经皮渗透的影响

3.6.1 白芥子各类成分的促透作用

分别制备含5%白芥子碱、5%白芥子苷和黄酮、5%白芥子多糖、5%白芥子脂肪油和0.3%白芥子挥发油的蛇床子凝胶，按相同条件进行离体经皮渗透试验，所得结果见表1.

表1 白芥子各类组分对蛇床子中蛇床子素经皮渗透的影响

由表1实验结果可知12 h的渗透速率大小依次为:0.3% 挥发油(14.588 0 μg·cm－2·h－1)＞5%苷和黄酮(8.483 μg·cm－2·h－1)＞5% 多糖(7.624 μg·cm－2·h－1) ＞ 5%白芥子碱(7.2950 μg·cm－2·h－1)＞ 空白对照(7.733 6 μg·cm－2·h－1)＞5%脂肪油(6.999 4 μg·cm－2·h－1).其中，白芥子挥发油对蛇床子中蛇床子素具有一定的促透皮作用，增渗透倍数为1.88.

3.6.2 白芥子挥发油的最佳促透质量浓度及与不同促渗剂比较

分别制备了含 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%白芥子挥发油，及含5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片的蛇床子凝胶，按相同条件进行离体经皮渗透试验，所得结果见表2.

由表2实验结果可知，白芥子挥发油各质量浓度均能明显促进蛇床子中蛇床子素的经皮渗透，且在百分含量为0.5%时促透效果最佳.5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片对蛇床子中蛇床子素的经皮渗透也具有促进作用，且渗透速率大小依次为:5%薄荷油(17.842 9 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 冰片(17.004 2 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 氮酮(16.656 0 μg·cm－2·h－1)＞0.5%白芥子挥发油(16.610 1 μg·cm－2·h－1)，增渗透倍数分别为:2.31、2.21、2.19 和 2.10.

表2 白芥子挥发油及不同促渗剂对蛇床子中蛇床子素经皮渗透的影响

4 讨论

4.1 透皮吸收促进剂的百分含量选择

透皮吸收促进剂的应用百分含量一般为1%～9%，其中以5%较为常用，因此本实验制备5%百分含量白芥子各类组分的凝胶剂进行筛选实验.但白芥子挥发油由于具有刺激性，本课题组前期试验研究表明其安全使用百分含量为0.5%，故选择0.5%以下的一系列百分含量进行透皮实验.

4.2 接受液的选择

蛇床子素的理化性质为不溶于水和冷石油醚，溶于碱水、丙酮、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯，可溶于沸腾的石油醚.故而本实验预实验以含不同百分比的乙醇的生理盐水液为接受液进行考察，结果30%乙醇－生理盐水溶液作为接受液效果最好，因此本实验采用30%乙醇－生理盐水溶液为接受液.

4.3 白芥子促进透皮吸收的物质基础为挥发油

白芥子中白芥子挥发油促透性最好，且在百分含量为0.5%时效果最佳.白芥子挥发油和其他促透剂都能促进蛇床子素的经皮吸收，其渗透速率大小依次为:5%薄荷油＞5%冰片＞5%氮酮＞0.5%白芥子挥发油.白芥子为中药引赤发泡药，其促渗机制可能是可逆地引起细胞膜蛋白质的构型变化，影响皮肤角质层结构，从而使皮肤的渗透性增强.

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