安宫牛黄丸对大鼠缺血性脑损伤后HSP70表达的影响

郑伟 牛立健 朱超 宋思新 侯大鹏 谢方民 张春普 曹春光

·实验研究·

安宫牛黄丸对大鼠缺血性脑损伤后HSP70表达的影响

郑伟 牛立健 朱超 宋思新 侯大鹏 谢方民 张春普 曹春光

目的 研究安宫牛黄丸对大鼠缺血性脑损伤的影响及机制。方法 60只研究用大鼠进行随机分组, 分为安宫牛黄丸治疗组(30只)和缺血对照组(30只), 再将两组各分为24、48、72 h三个亚组 。构建大鼠局部脑缺血模型, 缺血对照组给予等量生理盐水灌服, 而治疗组给予安宫牛黄丸, 1丸/次, 1次/d, 灌服, 直至到各亚组的观测时间点。然后对缺血区脑组织进行病理形态学分析, 并用免疫组化S-P的方法对半暗带热休克蛋白(HSP)70进行检测。结果 使用安宫牛黄丸的大鼠个亚组HSP70的表达显著高于使用生理盐水的对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。且安宫牛黄丸治疗组的大鼠病理形态改变较缺血对照组明显, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 HSP70是调节脑损伤中重要的内源性保护因子, 安宫牛黄丸可通过调节HSP70的表达进而起到保护缺血性脑组织的作用。

安宫牛黄丸；缺血性脑损伤；大鼠；热休克蛋白

随着当今社会的发展, 人们物质生活水平的提高, 生活压力的增加, 使得脑血管疾病(脑血栓形成、脑栓塞、脑出血等)的发病率不断增加, 西药被广泛引用治疗脑血管疾病,其见效快, 但其副作用较大, 从中医角度讲, 西药只治标不治本, 现在许多研究者把对治疗脑血管疾病的药物研究重点转移到中药上, 目前有许多中药对缺血性脑病有明显作用,其作用机制目前不是很明确。热休克蛋白(HSP)70是一种内源性保护因子, 具有促进细胞内糖异生和糖原合成的作用,从而提高应激能力, 保护细胞的功能结构。本文章主要研究安宫牛黄丸对缺血性脑损伤的保护作用, 并探讨HSP70基因表达的变化及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选用健康的大鼠60只, 体重200～300 g。随机分为安宫牛黄丸(选用北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药)治疗组(30只)和缺血对照组(30只), 再将两组各分为24、48、72 h三个亚组 。构建大鼠局部脑缺血模型, 缺血对照组给予等量生理盐水灌服, 而治疗组给予安宫牛黄丸1丸/次, 1次/d, 灌服, 每个点10只大鼠, 直至到各亚组的观测时间点,最后进行相应的比较。

1.2 方法 采用线栓法制作大脑中动脉(MCA)局部缺血模型［1］。大鼠用10%的水合氯醛(400 mg/kg进行腹腔注射麻醉,将其脑部固定于手术台, 颈部正中切口, 分离甲状腺, 用无菌纱布保护, 然后分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA), 并在ICA、ECA分叉处结扎ECA, 在右侧CCA出剪一V字形切口, 插入0.28 mm的尼龙线, 线长约18～22 mm, 将栓线插入到MCA起始处, 感觉有轻微阻力时停止插线, 并向外拉出一点即可实现阻塞MCA所有的血液来源,然后将CCA连同尼龙线一起结扎, 甲状腺复位, 关闭并缝合切口。切口局部给予甲硝唑冲洗消毒, 给予庆大霉素预防感染。术中体温用烤灯维持在37.5℃左右, 分笼饲养, 给予饲料喂养。入选标准:左前肢屈曲内收；爬行时左侧旋转；站立时向左侧倾斜, 符合上述标准的表明栓堵成功, 其余则失败。

1.3 观测指标和测评方法

1.3.1 神经功能缺损评分 参见Longa等5分制评分标准：0分, 无神经功能缺损；1分, 轻度神经功能缺损(前肢不能完全屈曲内收)；2分, 中度神经功能缺损(向患者转圈)；3分,严重神经功能缺损(向患侧倾斜)；4分, 昏迷、意识不清。

1.3.2 HSP70测定 首先制作细胞切片, 然后光镜下观察染色结果, 并按照免疫组化S-P的方法进行半定量分析［2］。采用病理图像分析仪随机选10个高倍镜非重叠视野记录阳性细胞数。

1.3.3 血清白细胞介素-10(IL-10)含量测定 大鼠在断头处死前提取血清, 备用, 采用酶联免疫吸附法检测IL-10的含量。1.4 统计学方法 用SPSS18.0统计学软件处理数据, 计量资料以均数±标准差( x-±s)形式表示, 实施t检验；计数资料以率(%)形式表示, 实施χ2检验, P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通过对神经功能评分的测定来看, 安宫牛黄丸治疗组可明显降低神经功能行为的评分, 较治疗前和缺血对照组存在显著性改变, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。

表1 不同时间点神经功能的评分( x-±s, 分)

2.2 HSP70 免疫组化测定在大鼠脑组织中可见HSP70的表达, 治疗组HSP70的细胞数明显高于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05), 各亚组HSP70细胞计数与缺血对照组之间有明显差异。结果详见表2。

表2 各亚组HSP70细胞计数( x-±s)

2.3 两组对大鼠缺血性脑损伤血清IL-10的影响 与缺血对照组相比较, 安宫牛黄丸治疗组的血清IL-10含量明显升高, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 两组血清IL-10的含量( x-±s)

3 讨论

缺血性脑损伤各种原因导致的脑部血液供应障碍, 出现组织缺血、缺氧性坏死, 出现相应的神经功能缺损, 发病率、致残率和死亡率均较高, 是人类的三大致死疾病之一。因此, 对该疾病的预防和治疗成为医学界研究的重中之重。如今, 许多医学者将对缺血性脑损伤的治疗研究转移到中医中药上［4］。中医上的缺血性脑病属于中风病其中一种, 对其中医治法有很多种, 如祛风化痰、活血通络、平肝潜阳、温肾开窍、回阳救阴等。本文章谈到的安宫牛黄丸出自吴鞠通的《温病条辨》, 由12味中药组成, 主要功用为清热开窍、解毒, 抗惊厥, 降压, 保护肝脏和大脑, 增加脑部血流, 研究表明安宫牛黄丸对缺血性脑损伤有保护性作用［3］。

热休克蛋白(HSP)70是一种应激蛋白, 是机体细胞在一些理化因素刺激后高效表达的一种蛋白质［4］。HSP70是一种保护性蛋白, 当机体受到各种恶劣环境影响时, 就会被大量释放出来, 从而维持细胞的正常生理活动, 阻止影响机体健康的蛋白质之间的相互作用, 从而增强机体的抵抗力, 起到保护性作用。随着医学界对热休克蛋白研究的不断深入, 该蛋白质在医学和生物工程等方面的前景十分广阔。本研究中的安宫牛黄丸通过作用于机体, 促进机体合成更多的HSP70,提高机体抵抗力, 增强脑组织的修复力, 对脑组织起到保护性作用。

［1］ 刘宗涛, 沙地克·沙吾提, 李继彬, 等.安宫牛黄丸对实验性大鼠脑缺血的保护作用.中西医结合心脑血管病杂志, 2011, 9(9):710-712.

［2］ 殷妮娜.安宫牛黄丸对大鼠脑出血后TNF-α表达的影响.咸宁学院学报, 2011,33(10):12-15.

［3］ 王冰, 王宗仁, 王洪典, 等.芪丹通脉片对大鼠海马局部缺血及HSP70蛋白表达的影响.第四军医大学学报, 2006(5):27.

［4］ 赵考考, 崔毓桂, 刘嘉茵.热休克蛋白10的研究进展.医学综述, 2011, 17(1):1-3.

2014-04-08］

山东省中医药科技发展计划项目(项目编号：2013-253)

271000 泰山医学院附属医院神经外科