特异性抗体免疫组化法检测EGFR突变价值的meta分析

马晴 王竞 钟殿胜 宁超 刘畅 肖平

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于HER家族的一员。研究[1]发现，EGFR在50%-90%的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者中高表达，参与肿瘤的血管新生、迁移和粘附过程，其扩增和突变已被认为是肺部肿瘤发生的主要机制之一。研究[2-4]表明，EGFR基因突变状态是决定EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）疗效最重要的预测因子。目前，已经报道的EGFR基因突变类型大约有60种[1]，包括外显子19的缺失、外显子18和21的单核苷酸的替换突变及20外显子的复制突变，其中外显子21的L858R和外显子19的缺失突变占突变的绝大多数，可达89%以上。

美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）NSCLC指南中明确指出，对于IV期非鳞NSCLC患者，应先行EGFR基因突变检测，如果存在EGFR基因突变，治疗上优先推荐EGFR-TKI。

目前EGFR突变检测方法较多，现有临床应用的方法中，直接测序法和ARMS法应用较广。DNA直接测序法，作为EGFR突变检测的金标准，可以检测所有的突变分析的区域，但其灵敏度较低，样本要求高，只能对含量大于30%的突变基因进行检测。ARMS法敏感，流程速度快、简单，数据分析要求低，但仅能检测已知突变，且试剂费用昂贵，临床中推广有一定困难。2009年Yu等[5]首次制备出了2种最常见的EGFR突变的特异性单克隆抗体——抗E746-A750缺失突变抗体和抗L858R点突变抗体，并应用于福尔马林固定、石蜡包埋组织的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测。IHC作为常规病理检查手段，具有标本处理方法简单、快速，价格便宜，且可以在临床病理科进行。近年来多项临床独立研究[6-15]应用特异性抗体检测NSCLC患者EGFR突变检测与直接测序法比较，其敏感度44%-100%，特异度85%-99%。本文通过meta分析判定IHC法诊断准确度及临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 检索策略 计算机检索Pubmed、中国医院知识仓库医学专题全文数据库（CNKI）、中国生物医学文献数据库（CBM disc）和万方数据库。检索时间：2009年1月-2013年2月。收集国内外公开发表的“关于特异性抗体免疫组化法检测EGFR突变价值”的文章。中文检索词为表皮生长因子受体突变、L858R点突变、抗体、E746-A750缺失突变、免疫组织化学法、非小细胞肺癌。英文检索词：epidermal growth factor receptor、EGFR、non-small cell lung cancer、NSCLC、E746-A750 deletion mutantion、immunohistochemical method、L858R point mutation。

1.2 纳入与排除标准 研究类型：使用EGFR突变特异性抗体L858R及E746-750del检测外显子21及外显子19突变情况，同时应用检测金标准DNA直接测序法比较其敏感度特异度的文献纳入标准：①研究类型为含有EGFR突变特异性抗体L858R及E746-A750del检测对NSCLC患者EGFR突变检测价值的前瞻性或回顾性研究；②研究对象采用DNA直接测序为金标准，文献需明确说明受试者病理类型；③文章提供了特异性抗体免疫组化检测在各病例组的真阳性（true positive, TP）、真阴性（true negative, TN）、假阳性（false positive, FP）、假阴性（false negative, FN）例数或通过文章提供的数据可以计算；④每组病例数均＞20；⑤文献中EGFR突变检测采用统一可评价的IHC方法及标准（IHC阳性定义：10%以上肿瘤细胞胞膜染色定义为阳性，DNA直接测序标本均来源于NSCLC患者的FFPE标本）。

排除标准：①IHC与其他检测方法（如ARMS法）比较，而无直接测序法对照的文献，主要因为ARMS法虽为常用临床检查方法，敏感度特异度高但仅能检测已知突变，对于IHC法阳性预测值（positive predictive value,PPV）和阴性预测值（negative predictive value, NPV）统计有一定影响；②采用除以上两种特异性抗体进行免疫组化的检测；③EGFR免疫组化无统一判定标准的文献；④重复性实验中，发表较早或样本量较小的文献排除。

1.3 数据提取 所有纳入研究均提取以下内容：①研究人群基本情况；②各个研究的对于特异性抗体免疫组化法检测EGFR突变筛检试验的真阳性、真阴性、假阳性和假阴性，由2名作者按照上述标准独立纳入文献和提取资料，而后交叉核对，意见不一致时通过讨论解决。

1.4 数据处理和统计学分析 整理原始文献并摘录数据，由2名作者独立输入数据，用meta-Disc 1.4进行分析。用各研究精确估计量在受试者工作特征（receiver operator characteristic curve, ROC）曲线平面所形成的图像是否呈典型“肩臂”状分布进行各研究间由阈值效应引起的异质性分析；用q检验（inverse variance chi-squared test）进行异质性检验，如果同质性好（P≥0.05, I2≤25%），采用固定效应模型进行数据合并；若存在异质性（P＜0.05,I2＞25%）采用随机效应模型分析。对比特异性抗体免疫组化方法与DNA直接测序法比较的敏感度、特异度，评判该方法的准确性。对各研究的原始数据（真阳性、假阳性、真阴性及假阴性的例数）进行整合，分别计算L858R及E746-A750del特异性抗体免疫组化的平均敏感度、特异度、比值比及各自的95%可信区间（confidence interval, CI）。采用Mose’s constant线性模型拟合SROC曲线，以诊断比值比（diagnositic odds ratio, DOR）、曲线下面积（aera under curve, AUC）和Q统计量评价免疫组化法对NSCLC患者EGFR突变诊断的准确度。以纳入meta分析的各研究的敏感度为Y轴，以（1-特异度）为X轴绘制SROC曲线，直观上评估诊断试验的准确性，曲线越靠近左上角，曲线下面积越大，其诊断准确性越高。按照α=0.05的检验标准进行统计学判断。

2 结果

2.1 检索结果及纳入研究文献 通过设定的检索词进行初步检索，共找到88篇文献。阅读文题和摘要排除62篇，初步纳入文献26篇。进一步阅读全文，排除未达到纳入标准的文献12篇，重复文献2篇，无法获得所需全部原始数据的文献2篇，最终纳入文献共10篇，如图1所示，其中2篇仅涉及L858R抗体，未涉及E746-A750del抗体的免疫组化。

图 1 文献筛选流程图Fig 1 Flow chart for study selection

2.2 纳入研究的基本特征 本文共纳入10项研究，E746-A750del免疫组化累计病例1,679例，L858R免疫组化累计病例1,041例，各研究免疫组化法例数、敏感度及特异度参见表1。

2.3 纳入研究的方法学质量评价，结果见表2。

2.4 Meta分析结果

2.4.1 异质性检验 以DOR作为效应量，分别分析L858R、E746-A750del免疫组化与直接测序的异质性，Q检验显示Cochran-Q分别为20.31和5.64，P＜0.05，P＞0.05，I2分别为65.5%和0%，L858R抗体免疫组化研究间存在异质性，故以下分析选用随机效应模型。E746-A750del免疫组化采用固定效应模型。

2.4.2 Meta分析 随机效应模型meta分析结果显示：应用特异性抗体免疫组化方法的合并敏感度、特异度、阳性似然比（positive likelihood ratio, PLR）、阴性似然比（negative likelihood ratio, NLR）和DOR比分别如图2-图6所示。

图2所示为E746-A750del和L858R对NSCLC诊断敏感度的森林图。E746-A750del鉴别NSCLC患者EGFR突变的平均敏感度为0.90（95%CI: 0.84-0.94, P=0.656,5 ），L858R的平均敏感度为0.65（95%CI: 0.59-0.70, P＜0.001）。

图3所示为E746-A750del和L858R对EGFR突变诊断特异度的森林图。E746-A750del鉴别EGFR突变的平均特异度为0.95（95%CI: 0.93-0.97, P＜0.001），L858R的平均特异度为0.99（95%CI: 0.98-0.99, P=0.001,6）。

图4所示为E746-A750del和L858R诊断EGFR突变的PLR分别为25.23（95%CI: 6.74-94.44, P＜0.001）和44.69（95%CI: 19.57-102.06, P=0.011,2）。

图5所示为E746-A750del和L858R诊断EGFR突变的NLR分别为0.13（95%CI: 0.09-0.20, P=0.770,5）和0.21（95%CI: 0.12-0.39, P＜0.001）。

图6所示为E746-A750del和L858R诊断EGFR突变的DOR分别为225.17（95%CI: 55.67-910.69, P=0.004,9）和267.16（95%CI: 132.45-538.88, P=0.775,6）。

图 2 E746-A750del（A）和L858R（B）敏感度森林图Fig 2 The forest plots of E746-A750del (A) and L858R (B) sensitivity

表 2 纳入研究的方法学质量评价Tab 2 Methodological quality assessment of included studies

2.4.3 SROC曲线 由E746-A750del和L858R的SROC曲线，计算灵敏度对数与（1-特异度）对数的Spearman相关系数ρ，E746-A750del和L858R的P值分别为-0.500和0.382，P均＞0.05，提示不存在阈值效应。SROC AUC两种检验方法分别为94.84%和98.13%，Q值为0.888,3、0.939,7（图7）。将每个研究逐一排除后行敏感性分析，结果显示汇总灵敏度和特异度无明显改变，提示meta分析结果的稳定性较好。

图 3 E746-A750del（A）和L858R（B）特异度森林图Fig 3 The forest plot of E746-A750del (A)and L858R (B) specificity

图 4 E746-A750del（A）和L858R（B）PLR森林图Fig 4 The forest plot of E746-A750del(A) and L858R (B) PLR. PLR: positive likelihood ratio.

图 5 E746-A750del（A）和L858R（B）NLP森林图Fig 5 The forest plot of E746-A750del(A) and L858R (B) NLP. NLR: negative likelihood ratio.

图 6 E746-A750del（A）和L858R（B）DOR森林图Fig 6 The forest plot of E746-A750del (A) and L858R (B) DOR. DOR:diagnostic odds ratio.

综上所述，E746-A750del和L858R特异性抗体免疫组化法鉴别EGFR突变，方法可靠，特异度高，灵敏度较高，IHC方法作为筛查突变方法可行性高，具有临床应用价值。

图 7 E746-A750del（A）和L858R（B）的SROC曲线Fig 7 The SROC curve of E746-A750del (A) and L858R (B)

3 讨论

本文对纳入的10项研究进行meta分析，通过合并诊断效应量、拟合SROC曲线比较L858R、E746-A750del特异性抗体免疫组化与直接测序法比较对EGFR突变的诊断效能。结果显示E746-A750del鉴别NSCLC患者EGFR突变的平均敏感度为0.90（95%CI: 0.84-0.94），平均特异度为0.95（95%CI: 0.93-0.97）； L858R的平均敏感度为0.65（95%CI: 0.69-0.70），平均特异度为0.99（95%CI:0.98-0.99）。两者结果综合显示特异性较高而敏感性稍差，结合相关文献，考虑敏感度差别主要源于该方法仅能检测已知最常见E746-A750del和L858R突变，而不能检测其他EGFR基因突变，如9 bp、12 bp、18 bp、21 bp和24 bp缺失或L861Q替代等。Dahabreh等[15]的一项meta分析报告显示，东亚人群中预测的特异性和敏感性分别为81%和81%。本研究结论与相关文献相符。

一般认为，PLR＞10或NLR＜0.1，基本可以确定或排除诊断。本研究得出的E746-A750del和L858R诊断EGFR突变的PLR分别为25.23（95%CI: 6.74-94.44）和44.69（95%CI: 19.57-102.6），提示两者阳性均可以辅助临床医师做出相应判断，具有临床应用价值。但E746-A750del和L858R的NLR分别为0.13（95%CI: 0.09-0.20）和0.21（95%CI: 0.12-0.39），提示二者阴性时不能排除EGFR突变的可能。

DOR反映诊断试验的结果与疾病的联系程度。取值＞1时，其值越大说明该诊断试验的判别效果较好；取值＜1时，正常人比患者更有可能被诊断试验判为阳性；取值=1时，表示该诊断试验无法判别正常人与患者。本研究中E746-A750del和L858R诊断EGFR突变的DOR分别为225.17（95%CI: 55.67-910.69）和267.16（95%CI:132.45-538.88），提示诊断试验的判断效果好。

本文通过对可提供四格表数据的10篇文献，计算合并敏感度、特异度、PLR、NLR、DOR，行异质性分析后绘制SROC曲线，SROC曲线又名综合受试者工作特征曲线，不受异质性影响，可综合灵敏度与特异度信息，综合评价诊断试验的准确性，曲线以灵敏度为纵轴，以1-特异度为横轴，原理为通过TRP、FRP进行Logit变换将TRP与FRO间非线性关系转变为一种线性关系，利用最小乘法进行参数统计，建立SPOC曲线回归方程并获得评价诊断试验准确度的统计量。分析本文SROC曲线显示，L858R和E746-A750DEL的AUC分别为0.948,4和0.981,3，Q*统计量分别为0.888,32和0.939,7，曲线靠近左上角，曲线下面积大，说明以上两种特异性抗体IHC鉴别EGFR突变的准确度均较高。本文纳入的研究间存在异质性，经Spearman相关系数检验，异质性与阈值效应无关，仍需做进一步做meta回归，寻找异质性的可能来源。

本次meta分析的局限性：①meta分析的局限性：检索到的文献不够全面。检索范围局限在已经发表的研究，对于未公开发表的研究，如会议论文无法获取，可能漏检一些灰色文献；检索语种局限于中文和英文，可能会漏检其它语种的相关研究；②纳入研究的局限性：特异性抗体IHC作为诊断性试验，采用盲法检测和盲法判断可尽量减少诊断的倾向性，而多数研究未报告是否采用盲法检测，存在测量偏倚的可能性。

综上所述，目前的IHC可以检测EGFR最常见外显子19缺失和21外显子L858R点突变这两种突变，其灵敏度与特异性与直接测序法比较无明显差别，且简单易行，具有一定临床应用价值，有望成为NSCLC患者EGFR突变检测的常规程序。