牛蒡颗粒剂对糖尿病大鼠氧化应激、细胞凋亡的影响及糖尿病心肌病变的防治

刘长山 李 萍 王秀军 柳 林 孙丽萍 刘海霞 明 义 刘 慧 丁颖超

(潍坊市人民医院内分泌科，山东 潍坊 261041)

研究证实，葡萄糖诱导的活性氧簇(ROS) 导致的氧化应激是糖尿病心肌病(DCM)的重要发病机制〔1〕。研究发现细胞凋亡同样参与了DCM发生发展的整个过程，但目前关于DCM过程中氧化应激与心肌细胞凋亡作用的研究报道甚少。本研究观察中药牛蒡对氧化应激和心肌细胞凋亡的影响及对DCM的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1糖尿病动物模型的制备及实验动物分组 健康雄性6周龄Wistar大鼠30只(由济宁医学院实验动物中心提供)，体重180～200 g。适应性喂养大鼠1 w后，随机取10只作为正常对照组，其余20只拟作为糖尿病观察组，于左下腹腔按60 mg/kg体重注射链脲佐菌素(STZ)溶液，注射后72 h断尾用罗氏血糖仪测血糖，血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病动物模型建立。将20只模型大鼠随机分为糖尿病组和牛蒡治疗组,每组10只，各组间血糖值无差异。

1.2试剂 STZ购自美国Alexi公司。牛蒡购自山东天达生物制药有限公司。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。Bcl-2、Bax免疫组化测定药盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。H-7500透射电镜,日本HITACHI公司。UV-260型分光光度计，日本岛津公司。

1.3标本的处理及收集 牛蒡治疗组灌胃给药150 mg·kg-1·d-1，糖尿病对照组和正常对照组则用等容量生理盐水1 ml·100 g-1·d-1灌胃干预。于实验的第4、8、12、16周测定血糖，16 w时处死大鼠。期间糖尿病对照组大鼠死亡1只，正常对照组及牛蒡治疗组无死亡。用10%水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取部分左室心肌组织制备心肌匀浆检测MDA含量及SOD水平。常规石蜡切片，透明、复水，按1∶100比例稀释的小鼠抗大鼠Bax和Bcl-2抗体，滴加生物素化羊抗小鼠IgG二抗工作液，加辣根过氧化物酶标记的卵白素工作液，DAB显色。另取大鼠左心室组织 8～10块，常规甲醛溶液固定进行HE染色，另取部分心肌组织经戊二醛固定，以备透射电镜观察。

2 结 果

2.1各组大鼠血糖变化 试验前各糖尿病大鼠血糖均显著高于正常对照组(P<0.01)，治疗16 w结束时，糖尿病组及牛蒡治疗组血糖与治疗前比较无显著差异(P>0.05)，两组间无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血糖比较

2.2各组大鼠心肌组织MDA含量、SOD水平的变化 与正常对照组比较，糖尿病各组MDA含量均升高(P<0.01)，SOD水平均降低(P<0.01)；与糖尿病组比较，牛蒡治疗组MDA含量降低(P=0.000)，SOD水平升高(P=0.000)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织SOD活性和MDA含量变化

2.3各组大鼠凋亡相关蛋白免疫组织化学染色结果 正常对照组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白明显表达,糖尿病组心肌细胞Bcl-2蛋白表达减少，牛蒡治疗组Bcl-2蛋白表达较糖尿病组增多。正常对照组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达较弱，糖尿病组心肌细胞Bax蛋白表达明显增多，牛蒡治疗组Bax蛋白表达较糖尿病组减少。

2.4心肌组织光镜HE染色观察 正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，无心肌纤维的破坏，细胞间隙正常，心肌间质及微血管等结构正常；糖尿病组出现心肌细胞排列紊乱、肿胀，肌原纤维紊乱，心肌纤维间结缔组织增多；牛蒡治疗组心肌细胞排列轻度紊乱，心肌纤维间结缔组织增生现象较糖尿病组有所减轻。

2.5心肌组织电镜下超微结构观察 糖尿病组表现为闰盘连接处部分心肌纤维出现肌丝减少、肌断裂，心肌纤维内部分线粒体空泡样变、髓样变，线粒体嵴模糊，嵴断裂，细胞核不规则,核固缩，核内染色质边集等；牛蒡治疗组显示闰盘周围线粒体病变不明显，少数线粒体旁边有小的空泡，线粒体嵴比较规整，部分线粒体嵴清晰，较糖尿病组有所减轻。

3 讨 论

DCM是糖尿病常见的严重的慢性并发症之一，是引起糖尿病心力衰竭的主要因素，也是糖尿病晚期死亡的主要原因。它是以心肌肥大、心肌纤维化、细胞水平钙转运缺陷、心肌收缩蛋白胶原形成和脂肪酸代谢异常等为特征的一种独特的心肌病变〔2〕。

研究发现DCM的发生发展与血糖升高程度、持续时间〔3〕密切相关。长期高血糖环境下心肌组织中ROS产生增加，抗氧化酶SOD活性下降，机体对氧自由基的清除能力大大减弱，机体对氧自由基的清除能力大大减弱，这种动态失衡势必造成体内大量ROS的有害蓄积，引起ROS的连锁反应，从而加重了氧化应激，氧化应激引起心肌脂质过氧化损伤，对心肌细胞内包括蛋白质，脂类与核酸等生物大分子造成氧化损伤，导致生物膜溶解和细胞凋亡，引起心肌组织的结构和功能严重受损，进而导致DCM的发生〔4〕。

细胞凋亡是心肌细胞由肥大转向衰竭的重要病理改变，近年来大量的研究发现，心肌细胞凋亡在DCM的发生与发展中起着重要作用〔5〕。

凋亡相关基因可分为凋亡促进基因和抑制基因两种。这两类基因相互作用的结果决定细胞是生存还是凋亡。抑制基因中最具代表性的是Bcl-2，它可以阻止细胞凋亡〔6〕。Bcl-2基因的同源基因之一是Bax基因，它的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。

高血糖通过何种途径导致细胞凋亡的确切机制尚不完全清楚。有研究发现，高血糖导致氧化应激与细胞凋亡密切相关，当外源性活性氧及细胞内ROS 生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力减弱时可致细胞凋亡。氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：ROS损伤细胞中的DNA，除激活P53基因外，还引起多聚ADP核糖合成酶活化，耗竭辅酶Ⅰ(NAD)，消耗大量ATP，导致细胞凋亡。氧化应激诱导的与凋亡相关的基因除了与Bcl-2有关外，c-Myc和Fas-FasL也参与氧化应激诱导的细胞凋亡〔6〕。

本实验提示高血糖通过增加心肌组织氧化应激而促进凋亡相关基因表达，诱导心肌组织细胞凋亡而参与DCM的发生发展。中药牛蒡可能通过抑制心肌组织氧化应激、干预心肌组织细胞凋亡防治DCM的发生发展。

自日本人田川越等从牛蒡中获得牛蒡苷以来，关于牛蒡化学活性物质的研究取得了重要进展，从其果实、茎叶和根中分别获得30余种不同类型的天然化合物，并发现了多种重要的药理和生理活性〔7〕。本实验所用牛蒡采用天然牛蒡为原料，依据传统中药焙炒、煎煮的炮制方法结合现代生物提取技术，制成颗粒制剂。研究发现中药牛蒡具有抑制氧化应激及心肌保护作用，而且中药毒副作用极低，加上DCM病程迁延，这就决定其用药治疗的过程将是长期的甚至是终生的，药物的副作用及费用均应考虑。

4 参考文献

1Seager MJ,Singal PK,Orchard R,etal.Cardiac cell damage：a primary myocardial disease in streptozotocin-induced chronic diabetes〔J〕.Br J Exp Pathol,1984；65(5)：613-23.

2Malhotra A,Sanghi V.Regulation of contractile proteins in diabetic heart〔J〕.Cardiovasc Res,1997；34(1):34-40.

3Sambandam N,Abrahani MA,Craig S,etal.Metabolism of VLDL is increased in streptozotocin-induced diabetic rat hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2000；278(6):H1874-82.

4Aneja A,Tang WH,Bansilal S,etal.Diabetic cardiomyopathy:insights into pathogenesis,diagnostic challenges,and therapeutic options〔J〕.Am J Med,2008；121(9):748-57.

5Fang ZY,Prins JB.Diabetic cardiomyopathy:evidence,mechanisms,and therapeutic implications〔J〕.Endocr Rev,2004；25(4):543-67.

6Kamimoto Y,Sugiyama T,Kihira T.etal.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1,an antioxidative and anti-apoptotic protein,prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010；53(9):2046-55.

7刘树民，李玉洁，李淑莲,等.牛蒡根抗衰老作用的实验研究〔J〕.中医杂志，2004；45(8)：617-8.