老年宫颈鳞癌术后组织中Geminin、组织蛋白酶D和增殖细胞标志物67表达的关系

张 红 尤正芳

(复旦大学附属中山医院青浦分院妇科，上海 201700)

子宫颈鳞状细胞癌发病率呈双峰形，即在青年人和老年人多发。老年宫颈癌常与人乳头瘤状病毒(HPV)感染不相关，即与病毒无关，而与癌基因及相关蛋白的表达失常密切相关。细胞周期相关因子Geminin是位于细胞核的小分子多功能蛋白，具有复杂的结构和功能区域，并在细胞增殖、胚胎发育和肿瘤生长方面发挥重要作用〔1，2〕。组织蛋白酶(Cath)-D是具有肽链内切酶活性的蛋白，是在缺氧时诱导产生的蛋白之一，Cath-D高表达时不仅可以调节肿瘤细胞的增殖过程，还可能对脉管形成有一定作用〔3〕。增殖细胞标志物(Ki)67是与细胞周期密切相关的细胞增殖标志物，其在G1、S、G2和M期有表达，而在G0期无表达〔4〕。目前认为Ki67是最理想的标记肿瘤细胞增殖的蛋白。本文探讨老年子宫颈鳞状细胞癌术后组织中Geminin、Cath-D和Ki67的表达及其相关性。

1 材料和方法

1.1临床资料 2010年1月至2012年12月我院妇产科行子宫颈鳞状细胞癌根治手术的老年患者132例作为观察组，术后立即取组织，放于-80℃冰箱中待检。纳入均依据WHO标准，并经病理学医师再次核对。年龄60～84〔平均(69.0±6.2)〕岁。其中角化型鳞癌40例，非角化型鳞癌92例。手术前均未进行放、化疗。同时选取老年子宫脱垂并诊断为慢性子宫颈炎的老年宫颈鳞状上皮组织70例作为对照组，术后立即取组织，放于-80℃冰箱中待检。年龄60～80〔平均(67.5±5.5)〕岁。两组一般临床资料无明显差别，具有可比性。

1.2流式细胞术检测Geminin、Cath-D和Ki67的表达 Geminin、Cath-D和Ki67蛋白的浓缩液均由武汉博士德生物工程有限公司代购。在正式实验前应用免疫组化方法进行预实验，依不同比例进行稀释，选择染色最理想的浓度进行流式细胞术的正式实验。取出冻存组织，置于75%酒精中固定24～48 h后，制备组织的单细胞悬液(1×106/ml)，取1 ml，分别加入Geminin、Cath-D或Ki67一抗，在室温中孵育30 min，加入PBS 10 ml洗涤一次，弃上清，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清。加入PBS 0.1 ml，过滤后用上机检测(美国BC公司生产的流式细胞仪)，应用 Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。

1.3Geminin、Cath-D和Ki67的判定方法 以荧光指数(FI)表示Geminin、Cath-D和Ki67蛋白表达的相对含量。FI=蛋白表达的荧光强度/对照样品平均荧光强度。

1.4统计学方法 应用SAS6.12软件进行t检验和相关分析。

2 结 果

2.1两组Geminin、Cath-D和Ki67的表达比较 观察组Geminin、Cath-D和Ki67的表达量明显高于对照组(P<0.000 1)。见表1。

表1 两组中Geminin、Cath-D和Ki67表达水平比较

2.2观察组不同临床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表达比较 观察组Geminin、Cath-D和Ki67表达与肿瘤的最大径、是否累及宫颈管及临床分期密切相关(P<0.05)。见表2。

2.3观察组Geminin、Cath-D和Ki67表达的关系 观察组Geminin和Ki67(r=0.58，P=0.011 2)、Cath-D和Ki67(r=0.47，P=0.027 4)的表达均具有正相关性。

表2 观察组不同临床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表达的比较

3 讨 论

老年患者癌变常起源于萎缩的鳞状上皮，常常是非HPV感染相关的。由于老年患者常伴有退性改变及激素分泌减少，因此其癌变过程可能更复杂。近年研究表明老年患者宫颈鳞状上皮的异常增殖是引起病变的重要因素，因此促进增殖的基因和蛋白起的作用较为明显〔4,5〕。Geminin是1998年发现的一种小分子蛋白，其有二种异构体，即H型和L型，分别含有219个和216个氨基酸，有研究显示Geminin是一种核定位蛋白，其第50～116之间的氨基酸序列为典型的双向核定位信号，常由2个碱性氨基酸簇组成〔6,7〕。也有人认为Geminin在细胞有丝分裂期能够发生周期特异性降解，使细胞的增殖活性明显增强，细胞生长迅速〔8〕。近年研究关注Geminin在肿瘤中的表达，并发现其在肿瘤中表达升高〔9,10〕。Cath-D是定位在染色体11p15的基因，也是被普遍认为靠近H-ras的原癌基因〔11〕，其表达产物的分子量为34 kD，为溶酶体内的天冬氨酸蛋白酶。上皮细胞癌变后，Cath-D表达增高，引起自体蛋白的激活，使血浆酶原激活剂和胶原酶中的初始蛋白发生明显水解，Cath-D可以通过自分泌和旁分泌形式激活Cath-B，加速肿瘤细胞的增殖和细胞的活化。Ki67是常规应用于临床的一种增殖细胞标志物，其特点是稳定〔12〕，存在于细胞周期的G1、S、G2和M期，其蛋白表达在细胞核中，其功能与细胞的有丝分裂密切相关〔13〕。

本研究的结果提示Geminin、Cath-D和Ki67高表达可以有效促进肿瘤的发生过程。Geminin在作用过程中可以精确地调节DNA复制，在S、G2和M期特异性聚集、阻止MCM2-7与复制特许物有效地连接〔14〕，抑制DNA的过度复制〔15〕。Cath-D作用可能具有多元性，即通过多种通路调节肿瘤进展，如其作为雌激素调节的溶酶体蛋白酶，调节肿瘤细胞外基质的降解，加速肿瘤进展，其次Cath-D还可以促进肿瘤的血管生成，为肿瘤提供其生长必需的氧和营养〔16〕。本文结果提示Geminin、Cath-D和Ki67参与肿瘤的生长及侵犯，与肿瘤的进展关系密切。由于以上因素均为临床判断肿瘤生物学过程及预后的相关指标，因此术后常规检测组织中Geminin、Cath-D和Ki67的表达，对判断肿瘤生物学行为及初步判断患者预后可能有一定价值〔17〕。Geminin、Cath-D与Ki67之间具有正向协同作用，也提示Geminin和Cath-D通过影响Ki67表达的增殖指数，发挥促进肿瘤生长及癌性增生的作用。但是其作用机制及作用途径有待更多基础实验证实。

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