黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

侯 阳 李福智 左中夫 刘学政

(辽宁医学院科学实验中心，辽宁 锦州 121001)

黄芪多糖(APS) 为中药黄芪中重要有效成分之一。研究表明，APS具有广泛的药理作用，在糖尿病(DM)治疗中具有重要意义〔1〕。DM周围神经病变(DPN)是DM常见的并发症之一，周围神经受累的患者可占糖尿病患者的50%～90%，并且随着年龄与糖尿病病程的增加，DPN发病率进一步升高〔2〕。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有干细胞的共性，即具有自我复制和不受控制的自发分化能力，在不同条件下可以分化为所有中胚层来源的组织，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等〔3～6〕。本文拟通过体外实验验证APS注射液诱导BMSCs向神经样细胞的分化。

1 材料与方法

1.1材料 4周龄雌雄不限的SD大鼠2只，体重(110±10)g，由辽宁医学院动物实验中心提供。DMEM /F12培养基购于HyClone 公司(批号NWF0426)、乙二胺四乙酸(EDTA)购于Sigma公司(批号E6758)、胎牛血清(FBS)购于Thermo Fisher 北京公司(批号NVA0227)、兔抗大鼠单克隆抗体CD44、CD455购于美国 BD 公司(批号分别为5518、55752)。APS：西安鸿生生物技术有限公司产品，批号：100223；规格：1 000 g/袋；纯度>95%。

1.2方法

1.2.1BMSCs的培养及鉴定 采用贴壁筛选法和密度梯度离心法获取BMSCs：取SD大鼠2只，拉颈处死后，酒精浸泡消毒，在不破坏股骨的情况下解剖下肢，将股骨从肢体中分离出来。切除股骨上的肌肉和肌腱，用无菌纱布擦拭除去骨上的剩余组织。剪除骨的两端，暴露内部骨髓。用注射器吸取DMEM/F12 培养基并含15% FBS 5 ml冲洗每根股骨。进行细胞计数，按1×107细胞/cm2接种于25 cm2培养瓶，置于10% CO237℃ 恒温培养箱中培养。每3天进行分瓶。传至第3代时消化，用钝头吸管吹打成单细胞悬液进行细胞计数，调整细胞密度，加入荧光标记抗体避光4℃孵育30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，5 min/次，应用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD44、CD45的表达。

1.2.2免疫组织化学检测 按照不同的诱导方式将BMSCs分三组：①对照组：10% FBS的DMEM/F12培养基；②化学方法诱导组：诱导前培养孔板内加入1 mmol/L的β-巯基乙醇(BME)预诱导24 h，更换无血清DMEM/F12培养基及5 mmol/L的BME诱导；③APS组(予黄芪多糖 20 mg/L)。选取诱导的BMSCs，用 PBS(pH 7.2～7.6)漂洗3次后再用10%甲醛固定30～60 min。分别滴加适当稀释的神经微管蛋白-βⅢ(Tuj1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)一抗4℃过夜。再加滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。

1.2.3免疫组织荧光检测 选取诱导3、5、7 d长有BMSCs的盖玻片，PBS洗3次，10%甲醛固定细胞30 min，PBS洗3次，30%H2O21份+纯甲醇50份混合浸泡15 min，蒸馏水洗3次，3%牛血清白蛋白封闭30 min，分别滴加稀释的Tuj1、GFAP一抗，阴性对照组用PBS代替一抗，甘油封片后在荧光显微镜下观察并摄像。

2 结 果

2.1BMSCs的形态学观察 BMSCs原代时悬浮于培养液中，细胞呈圆形，在显微镜下观察具有很强的折光性。第4～5天时，BMSCs呈多角形、短梭形或不规则形，传至三代以后细胞逐渐变为纺锤形，细胞排列呈明显的旋涡状，经流式细胞仪检测CD44表达阳性，为92.8%。CD45表达阴性，为2.4%，故认为体外培养的细胞为BMSCs。

2.2BMSCs诱导后的形态学观察 显微镜下观察APS组，在12 h后就有突起形成，随时间变化突起渐渐增多、增长；第3天时镜下观察细胞有神经细胞形态，细胞核增大，折光性增强，第5天形成2～4个大小不等的突起，细胞突起之间交织成网，随着时间的延长，几乎全部细胞都有典型神经样细胞形态。化学诱导组在加入诱导剂后细胞有突起伸出，变得细长呈树枝状，大部分细胞呈神经样形态改变，3 d 可见到一些细胞漂浮脱壁，随时间延长死亡细胞逐渐增多。第7天ACP组可见细胞具有典型的神经元样改变(见图1)。对照组无典型的神经样细胞形态。

2.3BMSCs诱导后免疫组化学和免疫荧光检测鉴定 ACP组，7 d后可见Tuj1阳性细胞随着时间的延长突出逐渐增多，可见胞体及核体逐渐增大，突出数目长短不一，突起进一步分叉相互连接，可见典型的神经样细胞形态。阴性对照组未见神经样细胞形态改变(图2，图3)。

图1 镜下诱导(7 d，×400)

图2 诱导5 d Tuj1阳性细胞(DAB，×200)

图3 诱导7 d Tuj1阳性细胞(DAB，×400)

3 讨 论

Woodbury等〔7〕首次用β-巯基乙醇、二甲基亚砜和4-羟基茴香醚作为主要诱导剂，在体外成功地将成年大鼠和人BMSCs诱导分化为神经元样细胞，诱导后80%细胞在形态上出现类似神经元的突起，表达神经元特异性醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)。随后，Sanchez-Ramos等〔8,9〕分别用表皮生长因子(EGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和视黄酸(RA)与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和双丁酰环酰苷酸也在体外将成年大鼠和人BMSCs成功地诱导分化为神经元和胶质细胞。项鹏等〔10～13〕利用丹参注射液分别将人、大鼠和兔的BMSCs诱导分化成为神经元样细胞，诱导后细胞NSE和NF表达阳性，GFAP阴性表达。近些年出现的诱导剂有化学药物、细胞因子等，随后还出现细胞因子和化学药物联合的方法，这些方法虽然能使BMSCs诱导成神经样细胞，但具有不同的细胞毒性，诱导率一般在50%～60%。之后又有人先后利用麝香多肽、当归、黄芩甙、绞股蓝、地黄多糖等作为诱导剂，成功地将不同来源的BMSCs诱导分化成为神经元样细胞〔14～18〕。本实验运用APS作为诱导剂，深入研究发现APS具有广泛的药理作用，具有增强免疫系统功能、抗炎症、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、降血糖等作用，从而解决体外诱导分化效率低及存活状况问题。尹雅玲等〔19〕发现APS组分-A3(APS-A3) ( 0.11，10 mg/ml) 剂量依赖性地保护了对氧磷(PARA)损伤的血管内皮依赖性舒张反应(EDRR)，阻滞了PARA 所致的、内皮细胞单层通透性(ECMP) 的升高、凋亡及形态学的改变，其保护作用与抗氧化剂超氧化物歧化酶作用相近。应用化学诱导剂存在细胞只能短期存活的问题。中药诱导剂作用长效持久，而多糖类具有非特异性免疫增强作用，能提高机体免疫功能，增强抗病能力，长期使用对组织细胞毒副作用小。

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