丹参酮ⅡA对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及诱导凋亡的作用

李 沫 陈立强 孔庆滨

(东北林业大学医院皮肤科，黑龙江 哈尔滨 150040)

老年人群皮肤鳞状细胞癌发病率呈逐年上升趋势〔1〕。丹参酮(Tan)ⅡA是从中药丹参中提取的脂溶性有效成分，对多种肿瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡有重要的调节作用〔2〕。但TanⅡA对人皮肤鳞状细胞癌作用研究尚未见报道。本研究体外观察TanⅡA对A431细胞的生长抑制和诱导凋亡影响，探讨其抗皮肤鳞状细胞癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂 人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株(中国协和医科大学)；TanⅡA(中国生物制品检定所，纯度≥98%)；二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)和DMSO(Sigma公司)；IMDM培养液和胎牛血清(GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)和AnnexinV-FITC(BD公司)。

1.2细胞培养 A431细胞株接种于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的IMDM培养液中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，48～72 h传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3细胞增殖抑制试验(MTT法) 取对数生长期细胞接种于96孔板，继续培养24 h后，分为实验组、空白对照组，实验组分别加入终浓度为0.5、1、2.5、5、10 μg/ml TanⅡA的 IMDM培养液100 μl，空白对照组加入等体积的不含TanⅡA的IMDM培养液。每个浓度设6个复孔，分别作用24、48、72 h后，加入新配置的MTT液，再培养4 h后，加入DMSO溶液，震荡摇匀，使结晶充分溶解，置酶标仪上测各孔吸光度值(A570 nm)，取6个复孔的平均值，根据公式计算细胞抑制率，抑制率=(1-实验组平均A570 nm值/对照组平均A570 nm值)×100%。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集不同浓度TanⅡA(0、2.5、5、10 μg/ml)作用48 h的各组细胞，制成单细胞悬液，加Annexin V-FITC与PI双标记活细胞，混匀后室温下避光孵育15 min，再加入1×结合缓冲液充分混合后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，应用Multicycle AV软件进行凋亡细胞分析。

1.5统计学分析 使用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析和两两比较LSD检验。

2 结 果

2.1TanⅡA对A431细胞增殖的影响 不同浓度的TanⅡA作用于A431细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制，各浓度组与空白对照组差异均有统计学意义(P<0.01)。0.5 μg/ml组和1.0 μg/ml组TanⅡA对A431细胞作用24 h生长抑制率差异不明显(P>0.05)；其余各组在作用时间相同时，随着药物浓度的增加，对A431细胞增殖抑制率有明显增加，各浓度组两两比较有统计学差异(P<0.05)；在同一药物浓度时，随着作用时间的延长，TanⅡA对A431细胞增殖抑制率也有明显差异(P<0.05)。见表1。

2.2TanⅡA对A431细胞凋亡的影响 2.5、5.0、10.0 μg/ml组细胞凋亡率(1.31%±0.41%、3.73%±0.74%、6.57%±0.58%)均明显高于空白对照组(0.26%±0.09%)(P<0.01)。细胞凋亡率随着TanⅡA浓度增加而上升(P<0.05)。见图1。

表1 各组A431细胞体外增殖抑制率比较

图1 TanⅡA对A431细胞凋亡的影响

3 讨 论

肿瘤细胞的增殖及凋亡异常是导致肿瘤形成、发展的关键原因之一。有效抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞的凋亡是临床应用药物治疗肿瘤的思路之一。TanⅡA是从中药丹参中提取的有效成分，具有一定的抗肿瘤作用，诸多研究者在肺癌〔3〕、鼻咽癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、白血病〔6〕等恶性肿瘤的体外细胞实验中证实TanⅡA具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本研究也发现，TanⅡA对体外培养的人皮肤鳞状细胞癌A431细胞具有明显的生长抑制作用，并能够诱导其凋亡，且具有剂量时间依赖性。

本研究结果表明TanⅡA对于A431细胞的抑制效应有明显的剂量依赖性。TanⅡA对于A431细胞的抑制效应有明显的时间和浓度依赖性。其作用机制可能与TanⅡA阻滞A431细胞周期和(或)上调了细胞内部分凋亡相关基因的表达有关，但其具体的作用机制尚需进一步研究。

4 参考文献

1方木平，易海英，刘汉忠.P105，CD105和PTEN在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性分析〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2011；25(12)：934-7.

2Kapoor S.TanshinoneⅡA：a potent，natural anti-carcinogenic agent for the management of systemic malignancies〔J〕.Chin J Integr Med，2009；15(2)：153.

3简晓顺，刘相富，陈健清.丹参酮ⅡA 抑制非小细胞肺癌 NCI-H520 细胞生长的研究〔J〕.新医学，2013；44(5)：347-50.

4戴支凯，黄大林，石京山，等.丹参酮ⅡA诱导人鼻咽癌 CNE 细胞凋亡〔J〕.中国中药杂志，2011；36(15)：2129-33.

5赵丕文，牛建昭，王继峰，等.丹参酮ⅡA抗乳腺癌细胞增殖作用研究〔J〕.中国药理学通报，2010；26(7)：903-6.

6刘晓丹，刘文达，刘培庆，等.丹参酮ⅡA对白血病K562细胞的体外诱导凋亡作用研究〔J〕.中草药，2010；41(10)：1663-6.